Para começar, certifique-se de que o layout do microscópio seja preparado na superfície da mesa óptica com todas as distâncias medidas com precisão. Em seguida, monte o laser de excitação sobre a mesa. Ajuste duas íris para a altura pretendida do laser e use essas íris para garantir que o feixe esteja nivelado e centralizado.
Posicione o estágio de translação, ou TS1, sob a localização do espelho 1 ou M1. Use o par de íris ajustado à altura exata para definir o caminho desejado do feixe de saída e orientar a colocação e o alinhamento de cada elemento refletivo. Em seguida, posicione M1 no topo do TS1. Em seguida, monte e alinhe o dicroico sobre a mesa.
Da mesma forma, monte o galvo e alinhe-o com as íris. Uma vez feitos os alinhamentos, posicione M2 e fixe M3 à mesa. Ajuste a altura e a posição até que o feixe esteja aproximadamente centrado em ambos os discos de alinhamento de vidro fosco.
Adicione suportes ao M3 em seguida. Em seguida, comece a montar a lente 1 na mesa. Ajuste a inclinação e a posição lateral até que a viga esteja centralizada nas placas de vidro fosco acima de M3. Posicione a lente 2 e verifique a colimação usando um espelho para rebater o feixe em uma superfície distante.
Use uma placa de índice ou alvo para rastrear o feixe e garantir que o feixe não mude de tamanho. Em seguida, ajuste a posição x, y do orifício com o suporte XY e a distância axial com o estágio unidimensional para maximizar a transmissão. Ajuste axialmente a lente 4 para focar o feixe de excitação na superfície do galvo e organize a lente 3 na mesa, seguida pela SL1.
Ajuste a distância axial de SL1 para formar um telescópio coliumado com lente 4 e, em seguida, posicione TL1 paralelo a SL1. Ajustar a altura da objetiva 1 no sistema de gaiolas até que a viga forme um disco arejado no teto. E, em seguida, continue ajustando até que o tamanho do disco seja minimizado.
Coloque o espelho quadrado no estágio de amostragem da objetiva 1 e ajuste o espelho axialmente até que o tamanho do perfil da viga seja minimizado após o dicroico. Monte o laser de alinhamento deslizando as hastes da gaiola nos orifícios vazios das duas placas da gaiola. Use um suporte de espelho cinemático e um espelho suspenso para alinhar os caminhos dos feixes de alinhamento e excitação.
Posicionar o espelho quadrado axialmente no estágio de amostragem do objetivo 1 para minimizar o perfil da viga após o dicroico. Inserir SL2 e TL2 no caminho de emissão nas respectivas distâncias. Ajuste os botões XY e a inclinação da objetiva 2 de modo que o feixe de alinhamento vermelho passe através da íris e do disco de vidro fosco.
Ajuste o estágio de translação 2 até que o feixe forme um pequeno disco arejado na superfície e, em seguida, continue ajustando o estágio de translação 2 para minimizar o tamanho do disco arejado. Para otimizar o galvo para inclinação na varredura de variantes, pressione o botão FSK no gerador de forma de onda para selecionar um sinal de onda triangular para o galvo e configurá-lo para uma frequência baixa, como 1 hertz. Observe o feixe de alinhamento na mesma superfície ou parede distante.
Monte a objetiva 3 cerca de 4-5 milímetros na frente da objetiva 2 em um ângulo de 0 graus e ajuste a altura para combinar. Posicione um disco de alinhamento de vidro fosco no plano focal compartilhado entre SL2 e TL2, conforme medido com uma régua. Uma vez que a luz de emissão preencha a abertura traseira do O3, monte um disco de vidro fosco na posição áspera do sensor da câmera e alinhe o centro do disco à luz de emissão que sai do O3. Posicione o TL3 atrás da objetiva 3 e ajuste a inclinação para alinhar a luz de saída com o disco de vidro fosco.
Coloque a câmera na distância medida da lente do tubo e ajuste a objetiva 3 axialmente do estágio de translação da gaiola até que o orifício esteja em foco na câmera. Reajuste a objetiva 3 em um ângulo de 30 graus em relação ao eixo óptico da objetiva 2 usando as linhas da tabela como guia. Remonte o alvo de teste de grade positivo na mesma altura axial e ilumine a grade com a luz de campo brilhante.
Varra a parte em foco do campo de visão pela tela horizontalmente, enquanto os quadrados da grade mantêm um tamanho uniforme. Para alinhar a folha de luz oblíqua, posicione as lentes cilíndricas, ou CL, de modo que o feixe seja focalizado em um perfil de folha horizontal no plano focal de CL3. Insira e posicione uma fenda na orientação vertical no plano focal entre CL3 e lente 3.
No sensor da câmera, confirme se a folha de luz de 0 grau parece fina e vertical. Usando o controle de estágio de translação motorizado, traduza M1 em direção às lentes cilíndricas para inclinar a folha de luz. Insira a amostra de teste de microtúbulos marcada com rodamina pré-preparada no estágio da amostra e ajuste-a axialmente para que o corante seja iluminado pela folha de luz em cinco profundidades diferentes entre o centro do campo de visão e o lado direito da tela.
Em seguida, salve cada imagem. Abra as imagens em Fiji. Para cada imagem, usando a ferramenta Linha, desenhe uma linha horizontal do centro do campo de visão até o centro da folha de luz.
Em seguida, vá para Analisar, seguido de Perfil de Plotagem para calcular o ângulo da folha de luz acima de 01. Depois de calibrar o instrumento, monte a amostra de esferas tridimensional pré-preparada e clique no botão FSK no gerador de funções para definir uma onda triangular. Para encontrar a amostra, use o gerador de função para definir os parâmetros a partir de 20 mega-hertz de frequência, 400 milivolts de pico para pico de amplitude e 0,4 offset.
Role em Z manualmente até que o plano de amostra seja atingido e otimize a configuração Z. No programa micromanager, selecione um tempo de exposição e abra a janela de aquisição multidimensional. Defina o intervalo como 30 e use a caixa de contagem para escolher o número de quadros.
Depois que os parâmetros estiverem definidos, registre um lapso de tempo para uma varredura completa do volume. As varreduras volumétricas da rede de microtúbulos reconstituídos mostraram que as estruturas tridimensionais cresceram densas em direção ao centro, resultando em regiões brilhantes de fluorescência. Em planos de imagem perto da lamínula da cobertura, a microscopia confocal resolveu filamentos únicos ao redor da periferia do Astar com fundo adicional em direção ao centro devido a sinais fluorescentes fora de foco vindos de cima.
No entanto, mover alguns mícrons em Z rapidamente reduziu a qualidade das imagens devido às seções densas fora de foco do Astar. A iluminação de plano único da folha de luz eliminou os sinais fora de foco, permitindo qualidade de imagem comparável entre os planos.
