Para começar, coloque os moldes de micropoço PDMS, a solução de enxágue antiaderente e o desgaste de laboratório necessário em uma coifa de cultura de tecidos. Para lavar os moldes de micropoços PDMS, use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar 300 microlitros de solução de enxágue antiaderente a cada poço. Em seguida, centrifugar a placa, 1, 620 G por três minutos.
Use uma bomba de vácuo e uma pipeta Pasteur para aspirar a solução. Em seguida, coloque 500 microlitros de suspensão celular na concentração desejada nos micropoços e centrifugar a placa a 1.620 G por três minutos. Coloque a placa em uma incubadora umidificada para permitir a formação de esferoides.
Para colher os esferoides, usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione firmemente 500 microlitros de meio completo em cada poço. Pipetar o meio adicionado para cima e para baixo em cada quadrante três a quatro vezes para desalojar os esferoides. Em seguida, use a pipeta para aspirar suavemente o meio que contém os esferoides em um tubo de microcentrífuga.
Transfira 50 microlitros da suspensão de esteroides em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione sequencialmente acrilato de PEG de 4 braços e ditiol de PEG nele. Misture a solução resultante pipetando-a para cima e para baixo cerca de 10 vezes.
Para produzir 100 microlitros de uma solução precursora de hidrogel de PEG em peso de 10%, pipetar 20 microlitros da solução precursora de gel entre duas lâminas de vidro revestidas de parafilme separadas com espaçadores de silício de um milímetro e incubar as lâminas com solução precursora de gel para permitir a gelificação. Quando a gelificação do hidrogel estiver completa, usando uma espátula, descasque suavemente os géis das lâminas de vidro separadas. Coloque um gel por poço em uma placa de 24 poços, garantindo que a superfície que contém os esferoides fique voltada para cima.
Adicione 500 microlitros de meio completo a cada poço para submergir completamente o hidrogel. Coloque a placa de poço múltiplo em uma incubadora umidificada para cultivar as células. A técnica descrita utilizando moldes de micropoços resultou na formação de esferoides com formas esféricas e polidispersidade rigidamente controlada.
Para esferoides com 3.300 células por micropoço, o tamanho médio do esferoide foi de cerca de 250 mícrons e a circularidade foi maior que 0,8, considerando o valor 1 como uma esfera perfeita. Os diâmetros dos esferoides foram dependentes do tamanho do micropoço e do número de células por micropoço.
