Para começar, aspirar o meio dos poços onde as células encapsuladas em hidrogel são cultivadas na placa de 24 poços. Enxágue os hidrogéis pipetando 500 microlitros de PBS diretamente em cada poço contendo os hidrogéis e, em seguida, aspirar suavemente o PBS. Usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione 500 microlitros de solução fixadora por poço para fixar os esferoides na placa de 24 poços.
Deixe o fixador de molho por 30 minutos à temperatura ambiente, antes de pipetar a solução fixadora e descartá-la em um recipiente de resíduos designado. Em seguida, lave os hidrogéis com PBS três vezes, conforme demonstrado anteriormente. Se não for usado imediatamente, armazene os hidrogéis em 500 microlitros de PBS por poço a quatro graus Celsius por até uma semana.
Para corar as células encapsuladas com hidrogel, primeiro, prepare anticorpos primários adequadamente diluídos para nestina e SOX2. Após aspirar o PBS dos poços, adicione 50 microlitros dos anticorpos diluídos a cada poço. Incubar as células com os anticorpos por 24 horas para corá-las completamente.
Em seguida, usando uma pipeta de 1.000 microlitros, remova a solução corante e descarte os resíduos adequadamente. Depois de enxaguar os hidrogéis três vezes, armazene-os em PBS a quatro graus Celsius por até duas semanas antes da aquisição de imagens ou imagem imediatamente. Para limpar o esferoide corado para melhorar a transparência da imagem, primeiro aspirar o PBS de cada poço.
Em seguida, tratar sequencialmente os esferoides com 500 microlitros de 20%40% e 80%formamida por poço por 90 minutos cada. Finalmente, incubar os hidrogéis em formamida a 100% por 24 horas antes da obtenção de imagens. Os esferoides foram fotografados em diferentes profundidades de z-stack, permitindo a avaliação da viabilidade celular em cada local dentro da z-stack.
Uma projeção máxima utilizando a pilha esferoide representou o ponto mais alto de intensidade de luz dentro de cada local, simplificado em uma imagem. Imagens representativas de esferoides corados revelaram que o fator de transcrição de auto-renovação, SOX2, foi co-localizado com DAPI no núcleo. Ao contrário, o marcador de células-tronco nestina estava presente em todas as células.
Não houve diferença entre o esferoide livre flutuante sem gel e os esferoides encapsulados, possivelmente devido à inércia do gel de PEG utilizado. As imagens representativas de seções ópticas a cerca de 90 mícrons em esferoides limpos e não limpos revelaram que, quando a limpeza era realizada, o núcleo esferoide podia ser fotografado cerca de 30 mícrons mais profundo em comparação com um esferoide não limpo.
