Para começar, cultive o transformador de levedura selecionado em três mililitros de meio SD URA a 30 graus Celsius até que a saturação seja atingida. Medir a densidade óptica da cultura a 600 nanômetros. Centrifugar dois mililitros da cultura noturna a 14.000 G à temperatura ambiente.
Pipetar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão MES. Centrifugar a mistura a 14 000 G à temperatura ambiente.
Em seguida, remova o sobrenadante. Depois de lavar as células com tampão MES mais uma vez, ressuspenda as células em dois mililitros de tampão MES. Em seguida, despeje todo o volume em um reservatório de reagente.
Em seguida, configure o leitor de microplacas. Navegue até o ícone gerenciar protocolo e, em seguida, defina o tipo de medição para intensidade de fluorescência e o modo de leitura para varredura espectral. Insira o nome da microplaca para GREINER 96 F BOTTOM e defina a óptica inferior.
Acesse as configurações ópticas selecionando definir varredura sobre emissão. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 433 nanômetros com uma largura de banda de excitação de 10 nanômetros. Defina a faixa de comprimento de onda de emissão de 460 nanômetros a 550 nanômetros com uma largura de banda de emissão de 10 nanômetros e uma largura de passo de um nanômetro.
Defina o tempo de configuração para 0,1 segundos. Agora, prepare concentrações variáveis de solução de cloreto de sódio nos poços de uma placa preta de fundo claro de 96 poços. Carregue 150 microlitros de tampão MES nos três primeiros poços da linha A.Em seguida, pipete 150 microlitros da solução de osmólito correspondente em ordem crescente da esquerda para a direita.
Com uma micropipeta de 12 canais, pipetar a suspensão de levedura lavada várias vezes. Em seguida, transfira 50 microlitros da suspensão celular para cada poço. Pipetar o conteúdo de cada poço várias vezes para garantir uma mistura uniforme.
Meça os espectros de emissão de intensidade de fluorescência imediatamente. Observe os espectros de emissão de fluorescência sendo exibidos na tela. As construções IDR mostraram uma combinação dos espectros de emissão de mCerulean3 e citrino.
Para AtLEA45, o estresse hiperosmótico causou um aumento na intensidade de fluorescência do receptor com diminuição da intensidade de fluorescência do doador. Isso não foi observado na construção da albumina.
