Para começar, ressuspenda o peptídeo sintetizado que atua como um controle positivo em uma concentração de 0,1 miligramas por mililitro em DMSO. Misture o peptídeo ressuspendido com o peptídeo H4 de histona biotinilado para criar uma curva padrão. Em seguida, montar as reações de acetilação em duplicata em placas de PCR de 96 poços.
Uma reação de 20 microlitros deve ser composta por 10 microlitros da enzima, um microlitro de peptídeo H4, um microlitro de tampão 20X e um microlitro de TDT. Adicione um microlitro de DMSO ou o composto de teste em cada poço. Pipetar suavemente a mistura para misturar.
Em seguida, incube a mistura no gelo por 10 minutos para permitir a complexação do inibidor enzimático. Para a continuação da reação de acetilação, combinar dois microlitros de 4-Penten óleo co-enzima A com quatro microlitros de água. Adicione seis microlitros dessa mistura aos poços.
Após uma mistura suave, centrifugar a mistura a 300G durante 30 segundos à temperatura ambiente. Incubar o conteúdo a 37 graus Celsius por uma hora em tubos tampados. Temperar o conteúdo com 20 microlitros de ureia de oito molares e armazenar a menos 20 graus Celsius até processamento posterior.
Em seguida, pipete 80 microlitros de PBST em cada poço de placas pretas de 96 poços pré-bloqueadas BSA revestidas com NeutrAvidin. Adicione 40 microlitros de conteúdo de reação nos poços da placa. Em seguida, pipetar os peptídeos de curva padrão em duplicata para os poços restantes.
Agite suavemente os peptídeos em um agitador orbital por uma hora à temperatura ambiente para facilitar a ligação. Quando a ligação estiver completa, aspirar o líquido dos poços. Use uma lavadora de pratos para lavar os poços com 200 microlitros de PBST.
Para a reação de clique, adicione a mistura de cobre THPTA ao ascorbato de sódio em água e a azida de biotina em DMSO. Distribua 19 microlitros dos reagentes recém-misturados em cada poço. Sele a placa com papel alumínio.
Em seguida, incube-o a 37 graus Celsius por uma hora. Aspirar a solução dos poços antes de lavar como antes. Em seguida, adicione 100 microlitros de mistura diluída de Streptavidin horseradish peroxidase em cada poço.
Incubar à temperatura ambiente durante uma hora com agitação suave num agitador orbital. Para combinar os reagentes de detecção Amplex Red, pipete 500 microlitros de peróxido de hidrogênio diluído para o reagente Amplex Red. Adicione 50 microlitros desta mistura a 4,5 mililitros de fosfato de sódio.
Pipetar 100 microlitros da mistura de reação Amplex Red para os poços lavados. Em seguida, incube a placa à temperatura ambiente por 30 minutos longe da luz. Inicie o software SmartControl e clique em Plate Out.
Depois que a placa for transferida para o instrumento, clique no ícone Amplex Red e altere o layout da placa. Pressione o ícone Amplex Red novamente para ver o layout alterado. Em seguida, selecione os poços padrão no canto superior esquerdo do layout.
Altere o nome do arquivo e pressione Iniciar Ajuste. Uma vez definido o ganho, clique em Iniciar medição. Pressione Estado atual para observar a medição em tempo real.
Quando a medição estiver concluída, feche a guia. Em seguida, clique em Abrir Última Execução no painel superior. Navegue até a guia Marte.
Em seguida, pressione Exportar para Excel no menu inicial para exportar os resultados dos dados. Observou-se que os compostos A e C inibem a atividade do HAT1 em quase 100% para várias diluições.
