Para começar, pegue os ossos do fêmur, tíbia, pelve e úmero isolados de um camundongo. Use um bisturi para cortar as placas de crescimento dos ossos longos, removendo a epífise. Coloque-o em um prato de 10 centímetros com meio M199 mais 2%FBS no gelo.
Em seguida, use uma agulha de calibre 28 e uma seringa de 10 mililitros cheia de meio M199 mais 2% FBS para lavar a medula em um tubo de 15 mililitros no gelo. Coloque o osso lavado no prato com a epífise. Deixe o tubo de 15 mililitros na posição vertical no gelo até que a medula assente.
Em seguida, remova o meio M199 mais 2% FBS Adicione quatro mililitros do coquetel de dissociação B & M ao tubo de 15 mililitros e incube em banho-maria a 37 graus Celsius. Após a incubação, colete o sobrenadante e filtre através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo frio de 50 mililitros. Adicione dois mililitros de coquetel de dissociação B&M fresco ao pellet de medula óssea restante e retorne-o ao banho-maria.
Usando uma pipeta de um mililitro, pipete vigorosamente todos os pedaços restantes de medula óssea. Colete todas as suspensões celulares no mesmo tubo de antes. Adicione 20 mililitros de meio M199 com 0,5% BSA e EDTA de dois milimolares à suspensão celular.
Depois, centrifugue as células a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS com 0,5% de BSA e anticorpos de biotina. Incube em um agitador orbital por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, bata completamente as esferas magnéticas. Adicione 25 microlitros de grânulos ao tubo e incube novamente no agitador orbital. Coloque o tubo em um ímã correspondente por dois a três minutos e colete o sobrenadante em um tubo novo.
Quebre os ossos em pedaços menores no prato de 10 centímetros usando a extremidade plana de um tubo de 50 mililitros. Filtre o sobrenadante através de um filtro de células de 70 micrômetros para isolar fragmentos ósseos. Corte os fragmentos ósseos no filtro de células com uma tesoura.
Coloque o filtro com os fragmentos ósseos em um tubo de 50 mililitros e abra o filtro com o bisturi. Com uma pinça, transfira a fração óssea para cinco mililitros de mistura de dissociação murina B&M. Em seguida, coloque o tubo horizontalmente em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação de 120 RPM por 30 minutos.
Após a digestão, adicione 25 mililitros de meio M199 com 0,5% BSA e EDTA de dois milimolares. Filtre o sobrenadante contendo células estromais através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo frio de 50 mililitros.
