Fomos apoiados com assistência técnica especializada pela instalação de citometria de fluxo HSCI-CRM no Massachusetts General Hospital e no Bauer Core Facility na Universidade de Harvard. T.K e K.G foram apoiados pelo Conselho de Pesquisa Sueco e C.M. pela Fundação Alemã de Pesquisa. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee pela assistência na análise dos dados de sequenciamento de RNA de célula única.

Todo o trabalho com tecido humano foi conduzido após a aprovação do Conselho de Revisão Interna do Hospital Geral de Massachusetts (IRB). Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts (IACUC). Camundongos C57Bl/6, com 8 a 10 semanas de idade, machos e fêmeas, foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação de tecido tímico murino
<ol><li>Prepare os seguintes tampões e soluções.<ol><li>Meio 199 (M199) com 2% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Coquetel de dissociação murina: 0,5 WU / mL Liberase TM e 6,3 U / mL DNase I em M199 + 2% FBS (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>M199 com albumina de soro bovino (BSA) a 2% (p/v). NOTA: O meio contendo FBS pode ser alterado para BSA para melhorar a qualidade do RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a dissecção do timo murino<ol><li>Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e colocá-lo de costas. Molhe o pelo no peito borrifando etanol a 70% e prossiga para abrir a cavidade torácica.</li>
		<li>Disseque cuidadosamente o timo fazendo primeiro uma incisão transversal logo abaixo da caixa torácica com uma tesoura cirúrgica. Corte as costelas de cada lado do rato até a clavícula. Em seguida, corte o diafragma para que a parede torácica possa ser liberada. Levante as costelas com um par de pinças para expor a cavidade torácica.<ol><li>O timo é um órgão branco e bilobular, situado no topo da cavidade, logo acima do coração. Segure o timo com a pinça e corte suavemente o tecido conjuntivo que mantém o timo no lugar. Coloque o tecido tímico dissecado no poço de uma placa de 6 poços com M199 + 2% FBS no gelo. NOTA: Ao trabalhar com camundongos idosos ou condicionados por radiação ou cepas mutantes com defeitos tímicos, o timo pode ser tão pequeno que um microscópio de dissecção é necessário para extirpar o órgão de forma confiável.</li>
		</ol></li>
		<li>Usando um microscópio de dissecação, remova qualquer tecido extratímico usando uma pinça de ponta romba e uma tesoura de micro-mola.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar dissociação enzimática do tecido tímico murino (30 min em incrementos de 10 min)<ol><li>Coloque o timo limpo na tampa de um tubo de 15 mL e pique finamente o tecido com uma tesoura cirúrgica estéril. NOTA: Picar o tecido na tampa do tubo que será usado para a digestão minimiza a perda de tecido devido à transferência de um recipiente para outro. Isso é muito importante ao trabalhar com camundongos envelhecidos ou condicionados por radiação ou cepas mutantes com defeitos tímicos. O pequeno tamanho do timo nesses ambientes exige a necessidade de reduzir a perda de material sempre que possível.</li>
		<li>Adicione 2 mL de coquetel de dissociação murina ao tubo de 15 mL, coloque a tampa contendo os pedaços de timo e inverta 5 vezes para garantir que o tecido seja ressuspenso no coquetel de dissociação.</li>
		<li>Para evitar vazamentos, enrole a tampa do tubo em filme de parafina. Em seguida, colocar o tubo horizontalmente num banho-maria a 37 °C com agitação de 250 rpm. Incubar por 10 min. NOTA: O sucesso do protocolo de digestão depende da incubação ser realizada a 37 °C e com agitação. O protocolo descrito foi otimizado usando um banho-maria agitado. Se isso não estiver disponível, outras abordagens que permitem a agitação em um ambiente aquecido podem funcionar, mas recomendamos que o protocolo seja otimizado para essas configurações primeiro.</li>
		<li>Coloque o tubo de 15 mL em uma prateleira e deixe os pedaços de tecido assentarem. Remova cuidadosamente o sobrenadante e passe-o sobre um filtro de células de 70 μm em um tubo gelado de 50 ml.</li>
		<li>Repita as etapas 2 a 4 duas vezes para um total de 3 rodadas de digestão. O tecido deve estar mais ou menos completamente dissociado até o final da última incubação.</li>
		<li>Adicione 20 mL de M199 + 2% de FBS à suspensão celular coletada. Gire para baixo a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender num volume adequado de M199 + 2% FBS. Em seguida, prossiga para a contagem de células. NOTA: O volume de M199 + 2% de FBS para ressuspender dependerá do estado do timo. Para camundongos de 6 a 10 semanas de idade, recomendamos ressuspender o tecido em 3-4 mL de M199 + 2% FBS. No entanto, para experimentos usando tecidos envelhecidos ou condicionados por radiação ou cepas mutantes com defeitos tímicos, o tamanho pequeno do timo exigirá volumes menores, variando de 0,1 a 1 mL.</li>
		<li>Conte as células diluindo a suspensão celular 1:2 em solução de azul de tripano a 0,4% (p/v). Carregue as células em um hemocitômetro e conte em um microscópio de campo claro. Conte as células não coradas para determinar o número de células vivas por mililitro e o número de células coradas de azul para avaliar a viabilidade da amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a classificação celular ativada por fluorescência do estroma tímico murino<ol><li>Gire as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda as células a uma concentração de 5 x 107 células / mL em M199 + 2% FBS suplementado com 25 U / mL de inibidor de RNase protetora (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Adicione o bloco Fc murino (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração de 2 μg / mL e incube por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Manchar as células com os seguintes anticorpos: CD45-PE/Cy7 (4 μg/ml), Ter119-PE (4 μg/ml), CD31-BUV737 (2 μg/ml) e EpCam-BV711 (2 μg/ml) (ver Tabela de Materiais) durante 30 min a 4 °C.</li>
		<li>Lave as amostras em M199 + 2% BSA e gire para baixo a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em M199 + 2% BSA contendo um corante de viabilidade como DAPI (0,5 μg / mL) ou 7-AAD (1 μg / mL) (consulte a Tabela de Materiais). Proceder ao isolamento FACS de células estromais tímicas seguindo protocolos estabelecidos19.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de tecido tímico humano
<ol><li>Prepare os seguintes tampões e soluções.<ol><li>Médio 199 (M199) com 2% (v/v) FBS.</li>
		<li>M199 com 1,5% (p / v) BSA.</li>
		<li>Coquetel de dissociação humana: 1 mg / ml de colagenase IV e 2 mg / mL de dispase e 6,3 U / mL de DNase I em M199 + 1,5% BSA (ver Tabela de Materiais). NOTA: A última etapa da digestão na preparação do tecido tímico humano inclui tripsina. Portanto, é essencial que todas as etapas até esse ponto sejam realizadas em tampão contendo BSA, pois o FBS inibirá a atividade da tripsina.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize o isolamento do tecido tímico humano<ol><li>Colocar o timo humano (colhido de acordo com o método19 publicado anteriormente) num volume adequado de M199 + 1,5% de BSA e guardá-lo em gelo até ao início do processamento.</li>
		<li>Ao trabalhar com tecido tímico humano, manuseie-o como se fosse potencialmente infeccioso, realizando o trabalho em uma capa de cultura de tecidos e usando precauções padrão de acordo com as diretrizes do CDC20.</li>
		<li>Coloque o tecido em uma placa de Petri de 10 cm com 10 mL de M199 gelado + 1,5% de BSA. Usando pinças e tesouras estéreis, limpe cuidadosamente a gordura extratímica ou o tecido que foi danificado durante a extração do órgão.</li>
		<li>Usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça, corte o timo em cubos de 1 cme 3 e use o êmbolo de uma seringa de 10 mL para empurrar suavemente as peças. Isso liberará alguns dos timócitos em desenvolvimento, reduzindo assim o volume de tecido a ser digerido. NOTA: Guarde a fração hematopoiética liberada se for necessária uma análise subsequente dos estágios de desenvolvimento dos timócitos. No entanto, não combine esta fração com a fração de células estromais gerada durante a digestão enzimática. Observou-se que agrupar as duas frações aumenta significativamente o risco de formação de obstruções na suspensão celular, reduzindo o rendimento de células estromais. Poucas células estromais são perdidas durante o esmagamento suave do tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar dissociação enzimática do tecido tímico humano (90 min em incrementos de 30 min)<ol><li>Transfira aproximadamente 5 mg dos pedaços de tecido tímico levemente esmagados para a tampa de um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, corte o tecido finamente usando uma tesoura cirúrgica estéril.</li>
		<li>Pipete 8 mL de coquetel de dissociação humana no tubo de 50 mL, coloque a tampa contendo o tecido tímico humano picado e, em seguida, inverta suavemente o tubo 5 vezes para garantir que todo o tecido seja misturado com o coquetel de enzimas.</li>
		<li>Prenda a tampa do tubo com filme de parafina para evitar vazamentos. Incubar o tubo horizontalmente em banho-maria agitado (250 rpm) a 37 °C durante 30 min.</li>
		<li>Coloque o tubo de 50 ml numa grelha e deixe assentar os pedaços de tecido tímico humano antes de retirar o sobrenadante e passá-lo sobre um filtro de células de 70 μm para um novo tubo de 50 ml colocado sobre gelo.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.2-1.3.4 para um total de duas rodadas de digestão com o coquetel de dissociação humana.</li>
		<li>Após a segunda rodada de digestão, adicione mais 8 mL do coquetel de dissociação humana ao tecido restante. Em seguida, pipete também 2 mL de tripsina a 0,25% no tubo de dissociação tecidual. Incubar por mais 30 min a 37 °C, agitando a 250 rpm. NOTA: É absolutamente essencial que o tempo de digestão do tecido humano seja de pelo menos 90 minutos, pois tempos de incubação mais curtos levam a rendimentos de células estromais drasticamente reduzidos.</li>
		<li>Uma vez concluída a última etapa de incubação, agrupar a suspensão celular e os fragmentos de tecido restantes com o sobrenadante coletado nas etapas anteriores, passando por um filtro de células de 70 μm. Adicione 3 mL de FBS à amostra para quebrar a reação de tripsina e coloque no gelo.</li>
		<li>Prossiga para a contagem das células conforme descrito na etapa 1.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a classificação celular ativada por fluorescência do estroma tímico humano<ol><li>Gire a suspensão celular do timo humano e ressuspenda a uma concentração de 5 x 107 células / mL em M199 + 2% FBS suplementado com 25 U / mL de inibidor de RNase protetora.</li>
		<li>Incubar com Fc Block humano (5 μg/mL) (ver Tabela de Materiais) durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Pinte a amostra por 30 min a 4 ° C com CD45-BV711 (2,5 μg / mL), CD235a-BV711 (2,5 μg / mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg / mL), CD66b-FITC (amostra de 20 μL / 100 μL), CD8-APC / Cy7 (amostra de 5 μL / 100 μL), CD4-BV605 (amostra de 5 μL / 100 μL), CD31-PE / Dazzle594 (10 μg / mL) e EpCam-BV421 (2,5 μg / mL) (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Lave as amostras em M199 + 1,5% BSA e gire a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em M199 + 1,5% BSA contendo um corante de viabilidade como DAPI (0,5 μg / mL) ou 7-AAD (1 μg / mL). Proceder ao isolamento FACS de células estromais tímicas seguindo protocolos estabelecidos19.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação de osso murino e tecido da medula óssea
NOTA: As frações ósseas e da medula óssea são preparadas em duas reações de digestão separadas para obter a máxima pureza das células estromais e a dissociação ideal dos tecidos. As amostras podem ser agrupadas após as etapas de digestão para serem classificadas como um compartimento estromal.
<ol><li>Prepare os seguintes tampões e soluções.<ol><li>M199 com 2% (v/v) FBS.</li>
		<li>Coquetel de dissociação Murine B&M (osso e medula): Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL e 10 U/mL DNase I (ver Tabela de Materiais) em M199 +2% FBS. NOTA: Prepare a mistura de dissociação B&M fresca e mantenha a mistura no gelo até o uso.</li>
		<li>M199 com 0,5% (p / v) BSA.</li>
		<li>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,5% (p/v) de BSA.</li>
		<li>M199 com 2% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA. NOTA: O FBS contendo meio pode ser alterado para BSA para melhorar a qualidade do RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a separação da medula óssea murina<ol><li>Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Pulverize com etanol 70% para molhar o pelo.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o fêmur, tíbia, pelve e úmero de cada lado e coloque-os em um poço contendo M199 + 2% FBS em gelo21,22.</li>
		<li>Remova todo o tecido muscular, ligamentar e cartilaginoso com lenços de tecido para minimizar os danos ao osso e preservar a camada periosteal. Coloque-os em um novo poço com M199 + 2% FBS no gelo.</li>
		<li>Use um bisturi e corte as placas de crescimento dos ossos longos para remover a epífise e coloque-o em um prato de 10 cm com M199 + 2% FBS no gelo.</li>
		<li>Retire a medula óssea dos ossos até ficar branca clara. Use uma agulha de 28 G e uma seringa de 10 mL cheia de 10 mL de M199 + 2% de FBS para lavar a medula em um tubo de 15 mL no gelo. Coloque o osso lavado no prato de 10 cm com a epífise. NOTA: A lavagem completa da medula óssea para a separação total dos tecidos resultará em uma melhor preparação da amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar dissociação enzimática do tecido da medula óssea murina (total de 30 min em incrementos de 10 min)<ol><li>Deixe o tubo de 15 mL em pé no gelo até que a medula afunde no fundo do tubo. Remova lentamente os 10 mL de M199 + 2% de FBS pipetando.</li>
		<li>Adicione 4 mL de coquetel de dissociação B&M ao tubo de 15 mL e coloque-o em banho-maria a 37 °C (sem agitação) por 10 min.</li>
		<li>Após 5 min, inverta o tubo três vezes e coloque-o de volta no banho-maria.</li>
		<li>Após os primeiros 10 minutos, certifique-se de que o pellet esteja no fundo e colete o sobrenadante enquanto filtra através de um filtro de células de 70 μm em um tubo gelado de 50 mL. Adicione 2 mL de coquetel de dissociação B&M fresco ao pellet BM restante e coloque-o de volta no banho-maria.</li>
		<li>Dissocie quaisquer pedaços de medula óssea restantes pipetando vigorosamente usando uma pipeta de 1 mL. Colete toda a suspensão celular resultante no mesmo tubo das etapas anteriores. Adicione 20 mL de M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA à suspensão celular coletada. NOTA: Na etapa 3.3.5, o tampão adicionado após a amostra final digerida contém EDTA para ajudar a inibir a atividade enzimática adicional.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a depleção de células hematopoiéticas do tecido da medula óssea murina.<ol><li>Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda em 500 μL de PBS + 0,5% de BSA com anticorpos de biotina (5 mg / mL) direcionados a CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 e CD3 (ver Tabela de Materiais). Transfira para um tubo de fundo redondo com tampa.</li>
		<li>Incube em um agitador orbital por 10 min em temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Vortex os grânulos magnéticos completamente e adicione 25 μL de grânulos magnéticos ao tubo.</li>
		<li>Incube em um agitador orbital por 5 min em temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Coloque o tubo no ímã correspondente por 2-3 min e colete o sobrenadante em um tubo novo. NOTA: A medula óssea pode ser agrupada ou mantida separada da fração óssea após esta etapa. Se a depleção da linhagem for bem-sucedida, a suspensão celular resultante deve ser desprovida de glóbulos vermelhos.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a dissociação enzimática do tecido ósseo murino.<ol><li>Quebre os ossos em pedaços menores no prato de 10 cm com a extremidade plana de um tubo de 50 mL. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de células de 70 μm para isolar os fragmentos ósseos no interior do filtro. NOTA: Alternativamente, um almofariz e pilão podem ser usados para fragmentação óssea. Essa opção, no entanto, tende a gerar mais detritos e menor viabilidade das células estromais quando o osso é moído em vez de quebrado. As células do estroma ainda estão ligadas ao osso e no osso, e o sobrenadante contendo células hematopoiéticas deve ser descartado.</li>
		<li>Use uma tesoura para cortar os fragmentos ósseos no filtro de células. Isso aumentará a área de superfície para uma dissociação enzimática mais eficiente. Lave o osso com 5 mL de M199 + 2% de FBS.</li>
		<li>Coloque a fração óssea em 5 mL de dissociação murina B & M (ver Tabela de Materiais) misture em um novo tubo de 50 mL.</li>
		<li>Para evitar vazamentos, enrole a tampa do tubo em filme de parafina. Em seguida, coloque o tubo horizontalmente em banho-maria a 37 °C com agitação de 120 rpm por 30 min.</li>
		<li>Após a digestão, adicione 25 mL de M199 + 0,5% BSA + 2 mM de EDTA e filtre o sobrenadante contendo as células estromais através de um filtro de células de 70 μm em um tubo gelado de 50 ml. NOTA: Verifique se os fragmentos ósseos resultantes foram visivelmente diminuídos pela digestão. Na etapa 3.5.5, o tampão adicionado após a amostra final digerida contém EDTA para ajudar a inibir a atividade enzimática adicional.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a classificação de células ativadas por fluorescência do osso murino e do estroma da medula óssea.<ol><li>Gire as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspenda em bloco Fc murino a uma concentração de 10 μg / mL em PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e incube por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Corar as células (até 10 milhões de células/100 μL de volume total de coloração) com os seguintes anticorpos: CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL), CD31-BV421 (0,66 μg/mL), CD140a-APC (2 μg/mL), Sca1-AF700 (0,66 μg/mL), CD51-PE (2 μg/mL), CD105-PE/encandeamento (2 μg/mL) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Deixe a calceína-AM equilibrar à temperatura ambiente e ressuspender em 50 μL de DMSO. Prepare-se fresco para cada uso. Manter à temperatura ambiente após a ressuspensão. Pré-diluir a calceína em PBS (0,1 mg/ml) antes de adicionar à amostra (20 μg/ml) já ressuspensa no cocktail de coloração de anticorpos e incubar durante 20-30 min a 4 °C no escuro.</li>
		<li>Lave as amostras em PBS + BSA 0,5% + EDTA 2 mM e centrifugue a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em PBS + BSA 0,5% + EDTA 2 mM. Proceder ao isolamento FACS de células estromais ósseas e da medula óssea seguindo protocolos estabelecidos19.</li>
	</ol></li>
</ol>

Otimizando o isolamento de células estromais do timo e da medula óssea

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging.">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li><li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells.">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li><li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus.">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951 (2013).</li><li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue.">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936 (2016).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts.">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells.">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li><li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml.">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li><li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).</li></ol>

D.T.S. é diretor e acionista da Agios Therapeutics e Editas Medicines; fundador, diretor, acionista e membro do conselho consultivo científico da Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, acionista e fundador da Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics, e diretor, fundador e acionista da Clear Creek Bio, consultor da FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio, e beneficiário de financiamento de pesquisa patrocinado pela Sumitomo Dianippon. DTS e K.G são inventores de patentes US20220143099A1.

As células estromais em órgãos hematopoiéticos são críticas para a produção normal de sangue e as perturbações do estroma hematopoiético podem resultar em graves prejuízos na manutenção hematopoiética e na resposta ao estresse 9,23,24. O conhecimento das células estromais hematopoiéticas é essencial para a compreensão das doenças hematológicas 7,9,10,24 <...

No adulto saudável, a produção de novo de células sanguíneas ocorre na medula óssea e no timo. As células estromais nesses locais são essenciais para a manutenção da hematopoiese, mas o estroma constitui menos de 1% do tecido 1,2,3,4. A obtenção de isolados puros de hematopoiese que suportam o estroma, portanto, constitui um desafio significativo, particularmente para multiômica de célula única que requer processamento rápido para obter amostras de alta qualidade. Componentes de diferentes coquetéis de digestão podem interferir em certas etapas da análise multiômica 5,6. Os protocolos aqui apresentados detalham o isolamento de uma ampla variedade de células estromais da medula óssea e tecidos tímicos.
Perturbações dos constituintes estromais na medula óssea e no timo resultam em profunda interrupção no desenvolvimento das células sanguíneas e podem resultar em malignidades 7,8,9. A hematopoiese que suporta o estroma é prejudicada após o condicionamento citotóxico e o transplante de medula óssea, resultando em redução da secreção de citocinas e fatores de crescimento que sustentam as células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs)2,10,11. Além disso, o envelhecimento afeta a medula óssea e as células estromais do timo, provavelmente contribuindo para o envelhecimento dos fenótipos hematopoiéticos. O timo é o primeiro órgão a sofrer extensa involução associada à idade. A gordura e o tecido fibrótico começam a substituir o estroma de suporte das células T já no início da puberdade12,13. Na medula óssea, o conteúdo de adipócitos aumenta com a idade e os nichos vascular e endosteal são significativamente remodelados 14,15,16.
Para permitir o estudo do estroma de suporte da hematopoiese em vários estados de estresse e no caso do timo de tecido humano e murino, otimizamos os protocolos de digestão publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Esses protocolos garantem o isolamento eficiente e reprodutível das células e são compatíveis com o sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e outros tipos de multiômica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (7-aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>664</td>
			<td>Males or females, 8-12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>65-0853-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td>&#160;2500 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31605-01</td>
			<td>Qualified One Shot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD235a-BV77</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45-BV77</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD4-BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD66b-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD8-APC/Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human EpCam-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>324220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase Inhibitor</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD140a-APC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-1401-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD31-BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD31-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD3-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45.2-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD51-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse EpCam-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ter119-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ter119-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemxyme&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stromal cell isolation from hematopoietic organs

O sequenciamento de célula única permitiu o mapeamento de populações de células heterogêneas no estroma de órgãos hematopoiéticos. Essas metodologias fornecem uma lente através da qual estudar a heterogeneidade anteriormente não resolvida no estado estacionário, bem como as mudanças na representação do tipo de célula induzidas por estresses extrínsecos ou durante o envelhecimento. Aqui, apresentamos protocolos passo a passo para o isolamento de populações de células estromais de alta qualidade do timo murino e humano, bem como do osso murino e da medula óssea. As células isoladas por meio desses protocolos são adequadas para gerar conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade. Os impactos da digestão da amostra, depleção da linhagem hematopoiética, análise/classificação FACS e como esses fatores influenciam a compatibilidade com o sequenciamento de célula única são discutidos aqui. Com exemplos de perfis FACS indicando dissociação bem-sucedida e ineficiente e rendimentos de células estromais a jusante na análise pós-sequenciamento, são fornecidos indicadores reconhecíveis para os usuários. Considerar os requisitos específicos das células estromais é crucial para a aquisição de resultados reprodutíveis e de alta qualidade que possam avançar o conhecimento na área.

In the healthy adult, de novo production of blood cells occurs in the bone marrow and the thymus. Stromal cells at these sites are essential for maintenance of hematopoiesis, but stroma constitutes less than 1% of the tissue1,2,3,4. Obtaining pure isolates of hematopoiesis supporting stroma therefore constitutes a significant challenge, particularly for single-cell multiomics that requires expedient processing to obtain samples of high quality. Components of different digestion cocktails may interfere with certain steps in multiomics analysis5,6. The protocols presented here detail the isolation of a wide variety of stromal cells from bone marrow and thymic tissues.
Perturbations of stromal constituents in both bone marrow and thymus result in profound disruption in blood cell development and can result in malignancies7,8,9. Hematopoiesis supporting stroma is damaged following cytotoxic conditioning and bone marrow transplantation, resulting in reduced secretion of cytokines and growth factors that sustain hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs)2,10,11. Furthermore, aging affects bone marrow and thymus stromal cells likely contributing to aged hematopoietic phenotypes. The thymus is the first organ to undergo extensive age-associated involution. Fat and fibrotic tissue start replacing T cell supportive stroma as early as the onset of puberty12,13. In the bone marrow, adipocyte content increases with age and the vascular and endosteal niches are significantly remodeled14,15,16.
To enable study of hematopoiesis supportive stroma across multiple stress states and in the case of the thymus of both human and murine tissue, we have optimized previously published digestion protocols1,2,8,17,18. These protocols ensure efficient and reproducible isolation of cells, and they are compatible with single-cell RNAsequencing (scRNAseq) and other types of multiomics.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa hematopoiética usando isolamento de células estromais para sequenciamento de células únicas

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Development of hematic cells in bone marrow and thymus is highly dependent on stromal cells for support. Perturbations of hematopoietic stromal cell function can lead to inefficient or even malignant blood production. Our lab is focused on understanding stromal cell regulation of hematopoiesis and how it can be manipulated for therapeutic benefits.The advent of single cell sequencing has driven a cascade of recent advances in many research fields. This is also the case in our field where single cell resolution has enabled the identification of heterogeneous stromal cell populations in hematopoietic organs that were previously unknown. Our protocols are optimized to address this, and we hope they will enable more research on stromal cells to tackle critical questions in the field.

Esses protocolos produzem variedades de células estromais reprodutíveis do timo e da medula óssea adequadas para análise de citometria de fluxo, bem como multiômica de célula única, como sequenciamento de scRNA. O tecido tímico murino sofre remodelação significativa em resposta a estressores, como o condicionamento citotóxico que precede o transplante de medula óssea ou o processo natural de envelhecimento. Como consequência, a celularidade tímica é drasticamente reduzida em ambas as configurações (<stro...

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Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

O desenvolvimento de células hemáticas na medula óssea e no timo é altamente dependente de células estromais para suporte. Perturbações da função das células estromais hematopoiéticas podem levar à produção de sangue ineficiente ou mesmo maligna. Nosso laboratório está focado em entender a regulação das células estromais da hematopoiese e como ela pode ser manipulada para benefícios terapêuticos.O advento do sequenciamento de célula única impulsionou uma cascata de avanços recentes em muitos campos de pesquisa. Este também é o caso em nosso campo, onde a resolução de uma única célula permitiu a identificação de populações heterogêneas de células estromais em órgãos hematopoiéticos que antes eram desconhecidos. Nossos protocolos são otimizados para resolver isso e esperamos que eles permitam mais pesquisas sobre células estromais para abordar questões críticas no campo.

stromal-cell-isolation-from-hematopoietic-organs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

741 visualizações.  Massachusetts General Hospital. O desenvolvimento de células hemáticas na medula óssea e no timo é altamente dependente de células estromais para suporte. Perturbações da função das células estromais hematopoiéticas podem levar à produção de sangue ineficiente ou mesmo maligna. Nosso laboratório está focado em entender a regulação das células estromais da hematopoiese e como ela pode ser manipulada para benefícios terapêuticos.O advento do sequenciamento de célula única impulsionou uma cascata ...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na pesquisa hematopoiética usando isolamento de células estromais para sequenciamento de células únicas

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Imunologia e Infecção

Isolation of Stromal Cells from Murine Thymic Tissue for Generating High&#45;Quality Single Cell Multiomics Datasets

To begin, position the euthanized mouse on a surgical platform and open the chest cavity. Using surgical scissors, make a transverse incision below the rib cage and cut ribs on each side of the mouse to the clavicle. Then cut the diaphragm to release the chest wall And lift ribs with forceps to expose the thoracic cavity.Hold the thymus with forceps, and gently cut the connective tissue holding the thymus in place. To perform enzymatic dissociation of murine thymic tissue, place the cleaned thymus in a 15 milliliter tube cap and use sterile surgical scissors to finely mince the tissue. Add two milliliters of murine dissociation cocktail to the tube.Attach the cap containing the thymus pieces and invert the tube five times to re-suspend the tissue. Wrap the tube cap in paraffin film. After incubation, place the tube in a rack and allow the tissue to settle.Remove the supernatant and pass it over a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter ice cold tube. Then, add 20 milliliters of M1 99 with 2%FBS medium to the cell suspension. Centrifuge the tube at 500 G for five minutes at four degrees Celsius.After discarding the supernatant, re-suspend the pellet in M1 99 and 2%FBS medium.

Isolamento de células estromais de tecido tímico murino para geração de conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade

Stromal Cell Extraction from Mouse Bone and Bone Marrow for Superior Single Cell Multi&#45;Omics Data

To begin, take the femur, tibia, pelvis, and humerus bones isolated from a mouse. Use a scalpel to cut through the growth plates of long bones, removing the epiphysis. Place it in a 10-centimeter dish with M199 medium plus 2%FBS on ice.Next, use a 28-gauge needle and a 10-milliliter syringe filled with M199 medium plus 2%FBS to flush the marrow into a 15-milliliter tube on ice. Place the flushed bone in the dish with the epiphysis. Leave the 15-milliliter tube upright on ice until the marrow settles.Then remove the M199 medium plus 2%FBS Add four milliliters of the B&M dissociation cocktail to the 15-milliliter tube and incubate in a 37 degree Celsius water bath. After incubation, collect the supernatant and filter through a 70-micrometer cell strainer into a cold 50-milliliter tube. Add two milliliters of fresh B&M dissociation cocktail to the remaining bone marrow pellet and return it to the water bath.Using a one-milliliter pipette, vigorously pipette any remaining bone marrow pieces. Collect all cell suspension in the same tube as before. Add 20 milliliters of M199 medium with 0.5%BSA, and two-millimolar EDTA to the cell suspension.Afterward, centrifuge the cells at 500 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in 500 microliters of PBS with a 0.5%BSA and biotin antibodies. Incubate on an orbital shaker for 10 minutes at room temperature in the dark.Next, vortex the magnetic beads thoroughly. Add 25 microliters of the beads to the tube and incubate again on the orbital shaker. Place the tube in a matching magnet for two to three minutes and collect the supernatant in a fresh tube.Break the bones into smaller pieces in the 10-centimeter dish using the flat cap end of a 50-milliliter tube. Filter the supernatant through a 70-micrometer cell strainer to isolate bone fragments. Cut the bone fragments in the cell strainer with scissors.Place the filter with the bone fragments on a 50-milliliter tube and open the filter with the scalpel. With tweezers, transfer the bone fraction to five milliliters of murine B&M dissociation mix. Then place the tube horizontally in a 37 degree Celsius water bath with 120 RPM shaking for 30 minutes.After digestion, add 25 milliliters of M199 medium with 0.5%BSA and two-millimolar EDTA. Filter the supernatant containing stromal cells through a 70-micron cell strainer into a cold 50-milliliter tube.