Procedimento de Citometria de Fluxo para Medição do pH Relativo do Glicossomo em Trypanosoma brucei Vivo

Para começar, inicie o software do citômetro de fluxo. Abra um novo experimento. Adicione o número desejado de amostras e nomeie-as.

Em seguida, configure um histograma de canal YL2-H ou RL1-H, um gráfico de pontos de área de dispersão direta versus área de dispersão lateral, um gráfico de pontos de área de dispersão direta versus altura de dispersão direta e um gráfico de pontos de canal BL1-H versus VL2-H. Coloque as células de controle de Trypanosoma brucei selvagens não coradas na porta de injeção da amostra e ajuste a posição do estágio. Para diminuir o tamanho do arquivo, desmarque os canais que não devem ser gravados.

Comece com uma vazão baixa para permitir ajustes. Em seguida, clique em Executar para iniciar a aquisição de dados. Ajuste a tensão YL2 ou RL1 para alinhar o pico principal dentro de 10 a 10 para a quarta unidade de intensidade de fluorescência relativa.

Ajuste as tensões de dispersão direta e de dispersão lateral para garantir que mais de 90% dos eventos estejam dentro do intervalo do gráfico de pontos. Defina o limite de dispersão para excluir detritos sem omitir células viáveis. Modifique as configurações de canal VL 2 e BL 1 para posicionar o pico primário do controle de tipo selvagem não corado dentro de 10 a duas a 10 até a quarta unidade de intensidade relativa de fluorescência.

Clique em Gravar e meça pelo menos 10.000 eventos. Em seguida, coloque a primeira amostra de Trypanosoma que expressa pHluorin, corada com iodeto de propídio ou vermelho de tiazol, na porta de injeção da amostra. Novamente, inicie a aquisição de dados a uma baixa taxa de fluxo após a realização do enxágue.

Monitore cada gráfico para garantir que mais de 90% dos eventos sejam capturados corretamente e que os canais VL2-H e BL1-H não estejam saturados. Salve os dados de cada amostra no formato de arquivo FCS e prepare-se para análise.