Para começar, realize citometria de fluxo em células de Trypanosoma brucei que expressam flúor. Abra um novo layout e arraste e solte os arquivos FCS adquiridos na janela de layout. Para limitar células vivas, selecione o controle wild-type sem manchas para abrir uma janela.
Analise os dados usando histogramas no canal YL2H ou RL2H. Neste caso, utilizar um histograma YL2H, uma vez que as amostras foram coradas com iodeto de propídio. Em seguida, estabeleça um portão bissetorial para separar células vivas e mortas, rotulando o portão esquerdo como vivo e o portão direito como morto.
Aplique e ajuste esse portão em todas as amostras. Verifique se o portão está desenhado corretamente visualizando-o em várias amostras no conjunto de dados. No controle do tipo selvagem sem manchas, clique duas vezes no portão ao vivo.
Defina o eixo X do gráfico de pontos para a área de dispersão para frente e o eixo Y para a área de dispersão lateral. Em seguida, use a ferramenta Polygon gate para delinear a população celular, rotulando-a como células. Exclua detritos ou células e agregados moribundos sendo cauteloso sobre suas posições típicas no gráfico de pontos.
Aplique o portão de células sob o portão vivo para todas as amostras, garantindo que ele cubra a população de células provável para todas as amostras. Clique duas vezes no portão de células no controle wild-type sem manchas para exibir os eventos dentro desse portão. Para ajustar o gráfico de pontos, defina o eixo X como área de dispersão para frente e o eixo Y para a altura de dispersão para frente.
Identifique a distribuição diagonal de células individuais neste gráfico de pontos, distinguindo-as de duplos. Utilize a ferramenta Polygon gate para circundar os eventos singlet, nomeando esse portão singlets. Aplique o portão de singlets sob o portão de células para todas as amostras, garantindo que ele exclua duplos enquanto inclui singlets, e ajuste o portão conforme necessário em diferentes amostras.
Na amostra de controle do tipo selvagem não manchada, clique duas vezes no portão singlets. Altere o eixo X do gráfico de pontos para BL1H e o eixo Y para VL2H. Usando a ferramenta Polygon gate, desenhe uma porta diagonal para capturar células fluorescentes de flúor-2 em VL2 e BL1.
Rotule esse portão como pHL positivo. Aplicar o portão positivo de pHL sob o portão singlets para todas as amostras. Ajuste a porta pHL para cobrir células com maior intensidade de fluorescência do que as células autofluorescentes no controle selvagem.
Para exportar as estatísticas, clique no editor de tabelas, depois edite a barra e, finalmente, selecione adicionar coluna. Incorporar colunas para contagem total unada, contagem positiva de pHL, frequência ao vivo do total, frequência positiva de pHl dos pais, VL2H mediana positiva para pHL e mediana BL1H positiva para pHL. Para ajustar as configurações de exportação no editor de tabelas, defina exibição como arquivo e texto como CSV.
Selecione o destino e o nome do arquivo e clique em criar tabela. Uma leve acidificação gradual foi observada ao longo do tempo em resposta à fome, que se estabilizou em 90 minutos. Após a reintrodução da glicose, conforme indicado pela linha verde, o pH glicossomal retornou aos níveis de pré-calibração em 30 minutos, sugerindo que o pH glicossomal é dinâmico e regulável em resposta à glicose.
