Para começar, sopre um jato suave de Argonne em um frasco de vidro contendo lipídios POPC enquanto gira suavemente o frasco. Quando os lipídios secarem como uma película no fundo do frasco, tampe-o frouxamente e transfira-o para um dessecador. Após uma hora, adicione 0,5 mililitros de água deionizada ultrapura para dissolver o filme lipídico.
Vortex a solução por dois minutos. Em seguida, molhe dois suportes de filtro e água deionizada. Coloque-os em cada um dos suportes internos da membrana.
Em seguida, coloque um filtro de policarbonato de 100 nanômetros entre os dois suportes internos da membrana, mantidos juntos pelo invólucro externo da extrusora e pela porca de retenção. Coloque a configuração no suporte da extrusora para terminar de configurar o mini aparelho de extrusão. Em seguida, carregue a mistura de água lipídica em uma seringa estanque de um mililitro.
Use clipes de braço oscilante para prender a seringa em uma extremidade da mini extrusora. Insira a segunda seringa na outra extremidade da mini extrusora, certificando-se de que esteja totalmente pressionada. Agora passe a mistura de água lipídica da seringa original para a vazia através do aparelho.
Depois de repetir a extrusão 11 vezes, transfira os SUVs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para montar o protocolo de expressão livre de células, pipete soluções de um a 3 plasmídeos de DNA que codificam para SFGFP solúvel ou variantes do receptor de glutamato SFGFP, RNAse murino e solução de SUV em um frasco. Adicione água deionizada ultrapura para trazer o volume de reação para 20 microlitros.
Transferir a solução de expressão sem células para uma placa inferior em V cónica de 96 poços. Incube a placa em um leitor de placas a 37 graus Celsius por quatro a cinco horas. Configure o leitor de placas com um ganho de 100, excitação de 485 nanômetros, emissão de 528 nanômetros, um tempo de execução de cinco horas e uma medição de intervalo de uma leitura a cada dois minutos.
Meça o sinal GFP a cada dois minutos para monitorar a reação livre de células em tempo real. O SFGFP solúvel teve a maior expressão entre as três proteínas.
