Para começar, prepare a solução tampão externa GUV em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Misturado espermidina, ATP, GTP, CTP, UTP, fosfato de creatina, acetato de magnésio, glutamato de potássio, HEPES, hidróxido de potássio, ácido folínico. glicose e estoque de aminoácidos.
Adicione água deionizada ultrapurificada para trazer o volume final da solução para um mililitro. Em seguida, em uma capela de exaustão, adicione 17,3 microlitros de solução de estoque POPC a um frasco de vidro de 15 mililitros. Para isso, pipete 1,08 microlitros de copolímero PEO-b-PBD.
Sopre cuidadosamente um fluxo suave de gás argônio no frasco de vidro enquanto gira o frasco para evaporar o clorofórmio. Em seguida, pipete 1,2 mililitros de óleo mineral leve no frasco de vidro. Vortex o lipídio e o óleo na velocidade máxima por 10 a 20 segundos.
Coloque o frasco de vidro em um forno a cerca de 50 graus Celsius por 20 minutos antes de fazer vórtice por mais 10 a 20 segundos na velocidade máxima. Em seguida, pipete 270 microlitros da solução externa GUV em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para isso, pipete 15 microlitros cada um de cinco molares de cloreto de sódio e 4,5 molares de cloreto de potássio.
Pipete suavemente 300 microlitros de mistura de lipídios e óleo em cima da solução externa GUV. Após a incubação, monte uma reação CFE pipetando as soluções 1 a 3, plasmídeo de DNA que codifica para sfGFP solúvel ou variantes do receptor de glutamato sfGFP, RNAse murina e uma sacarose molar em um frasco. Adicione água deionizada ultrapura para trazer o volume de reação para 20 microlitros.
Adicione 600 microlitros da mistura lipídica-óleo ao tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reação de 20 microlitros. Pipete vigorosamente para cima e para baixo durante um minuto para emulsionar a reacção. Coloque suavemente a emulsão interna em cima da camada de óleo no tubo.
Centrifugue por 10 minutos a 2000 g a quatro graus Celsius. Em seguida, pipete cuidadosamente o excesso de óleo e a solução externa do tubo da microcentrífuga. Misture suavemente o pellet GUV na solução restante para ressuspendê-lo.
Transfira a solução GUV para uma placa de fundo plano transparente de 96 poços para incubação. Transfira a placa selada para um leitor de placas para incubar a 37 graus Celsius por cinco a seis horas. Após a incubação, coloque a placa em um microscópio confocal invertido.
Concentre-se em uma região de interesse contendo os GUVs e, em seguida, capture as imagens em um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros. Salve as imagens no formato TIFF. Abra as imagens em um software de processamento de imagem.
Clique no painel de configuração Brilho/Contraste para abri-lo. Em seguida, ajuste o brilho e o contraste para tornar as proteínas fluorescentes visíveis. As reações de expressão livre de células do receptor de glutamato do tipo selvagem encapsuladas em GUV demonstraram excelente expressão e localização da membrana.
O receptor de glutamato de PRSP era propenso à agregação e formação de punção. A sfGFP solúvel foi expressa em GUVS e permaneceu no lúmen GUV.
