Análise da função mitocondrial em pequenas colônias de Candida glabrata induzidas por brometo de etídio

Para começar a cultivar Candida glabrata, organize todos os materiais experimentais na plataforma de trabalho. Escolha uma única colônia de C. glabrata de uma placa de levedura peptona dextrose ou YPD Agar . E transfira-o para um tubo de ensaio de vidro contendo 3 mililitros de meio YPD.

Incube por 14 a 16 horas a 25 graus Celsius com agitação a 155 RPM. Após a incubação, diluir a cultura em YPD fresco para obter uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,1. Incubar a cultura diluída a 25 graus Celsius por seis horas com agitação a 155 RPM.

Prepare uma suspensão de levedura com uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,1 em YPD a 3 mililitros. Adicione 30 microlitros de caldo de brometo de etídio e incube a suspensão de levedura durante a noite a 25 graus Celsius a 155 RPM em um ângulo de 45 graus. No dia seguinte, ajuste a densidade óptica da cultura para 0,65 com meio YPD fresco.

Em uma placa de 96 poços, adicione 20 microlitros da suspensão de levedura a 180 microlitros de PBS por poço para uma diluição de dez vezes. Placa 20 microlitros de cada diluição em quatro quadrantes da placa de ágar YPD. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, selecione quadrantes com cinco a 80 colônias e adicione 20 microlitros de trifenil tetrazólio a 20%. E adicione 20 microlitros de cloreto de trifenil tetrazólio a 20% diretamente no centro de cada colônia. Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 a 40 minutos.

Digitalize as placas a 1200 DPI usando um scanner óptico colorido de 48 bits. O agente intercalante de DNA, brometo de Ethidium, induz efetivamente pequenos mutantes de C. glabrata.