Análise da função mitocondrial em pequenas colônias de Candida glabrata induzidas por fluconazol

Para começar, coloque a cultura de Candida glabrata e o meio YPD em uma plataforma de trabalho. Ajuste a densidade óptica da suspensão de células de levedura em 600 nanômetros para 0,1 com meio YPD. Transfira um mililitro da suspensão celular para um tubo de cinco mililitros.

Mergulhe um cotonete estéril na suspensão de células de levedura. Passe o algodão para frente e para trás na placa de ágar Mueller Hinton, girando duas vezes a 60 graus. Em seguida, limpe o perímetro para uma cobertura uniforme.

Divida a placa em três setores iguais usando um marcador. Esterilize a pinça sobre uma chama por um a dois segundos. Após o resfriamento, coloque um disco vazio no centro de cada setor.

Adicione 12,5 microlitros de caldo de fluconazol a cada disco. Misture bem para evitar bolhas e incube a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas. No dia seguinte, adicione 20 microlitros de cloreto de trifeniltetrazólio a 20% diretamente no centro de cada colônia.

Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 a 40 minutos. Digitalize a placa a 1200 DPI usando um scanner óptico colorido de 48 bits. O tratamento com fluconazol induz efetivamente pequenos mutantes de C. glabrata.

Uma zona circular clara de nenhum crescimento circundou o disco de fluconazol na cultura T zero, indicando menor resistência a drogas no fungo parental. Na cultura T três, muitas colônias pequenas se formaram perto do disco, sugerindo resistência aos medicamentos após três tratamentos repetidos de terapia fotodinâmica.