Análise da função mitocondrial em colônias de Candida glabrata induzidas por terapia fotodinâmica antifúngica

Para começar, coloque a cultura Candida Glabrata e o meio YPD em uma plataforma de trabalho. Ajuste a densidade óptica da suspensão de células de levedura em 600 nanômetros para 0,65 com meio YPD. Misture um mililitro de suspensão de levedura com 111 microlitros de 2% de Rosa Bengala em um tubo redondo com tampa.

Incube a mistura a 25 graus Celsius por 15 minutos, girando em um ângulo de 45 graus a 155 RPM. Após a incubação, transfira a mistura para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 16.100 G por 2.5 minutos. Descarte o sobrenadante e raspe suavemente o tubo cinco vezes para ressuspender o pellet.

Lave a suspensão com PBS quatro vezes para remover toda a Rosa Bengala. Após a lavagem final, transfira 200 microlitros da suspensão de levedura carregada com Rose Bengal para cada um dos três poços em uma placa de 96 poços. Posicione a placa no Sistema de Luz Fotodinâmica com lâmpadas LED brilhando luz verde por baixo.

Ative o sistema de luz LED para fornecer a dose de terapia fotodinâmica de 4,38 joules por centímetro quadrado em dois minutos. Após a irradiação, adicione 20 microlitros de suspensão de levedura a um poço contendo 180 microlitros de PBS, criando uma diluição de dez vezes. Para cada fator de diluição, coloque 20 microlitros por quadrante nas placas de trado YPD.

Inverta a placa e incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, conte o número de colônias em cada quadrante. Usando a fórmula fornecida, calcule as unidades formadoras de colônias por mililitro.

Adicione 20 microlitros de cloreto de trifenil tetrazólio a 20% diretamente no centro de cada colônia e incube a 37 graus Celsius por 30 a 40 minutos. Digitalize as placas a 1.200 DPI usando um scanner óptico colorido de 48 bits. Depois de preparar a suspensão de levedura TZero na fase de crescimento de atraso, exponha-os a 4,38 joules por centímetro quadrado de luz verde na presença de 0,2% de rosa bengala.

Denote os fungos sobreviventes como T-1. Exponha os fungos sobreviventes à mesma dose de PDT. Pequenos mutantes de C-Glabrata exibiram crescimento mais lento em comparação com os fungos parentais não tratados de tamanho regular.

Um único tratamento de terapia fotodinâmica antimicrobiana inibiu significativamente o crescimento de C-Glabrata em três defasagens em comparação com o controle. C-Glabrata, 24 horas após o tratamento com terapia fotodinâmica antimicrobiana, exibiu uma distribuição bimodal do tamanho da colônia com colônias pequenas grandes e pequenas. As pequenas colônias que mantiveram uma cor branca exibiram disfunção mitocondrial, enquanto algumas colônias menores de cor vermelha e colônias de tamanho normal mantiveram a função mitocondrial normal.