Preparação de células eletrocompetentes para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa bacteriana deficiente em efluxo

Para começar, coloque todos os tubos de microfuga estéreis de 1,5 mililitro e cubetas de eletroporação estéreis no gelo. Em seguida, coloque a garrafa de água estéril, que foi armazenada a quatro graus Celsius, no gelo. Transfira 1,5 mililitros da cultura bacteriana durante a noite para um dos tubos de microfuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 13.000 G por dois minutos para peletizar as células.

Usando uma pipeta de um mililitro, remova todo o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Adicione mais 1,5 mililitros de cultura bacteriana no mesmo tubo de microfuga, centrifugar a 13.000 G por dois minutos e remover o sobrenadante. Adicione um mililitro de água gelada e estéril ao pellet de célula e ressuspenda com pipetagem suave até que o pellet não fique mais no fundo do tubo de microfuga.

Centrifugar as células ressuspensas a 13.000 G por dois minutos e remover cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de um mililitro. Ressuspenda suavemente o pellet de célula final em 200 microlitros de água gelada e estéril e transfira 100 microlitros da suspensão final da célula para o segundo tubo de microfuge de 1,5 mililitro gelado.