Para começar, obtenha o vírus clarificado a partir de células cultivadas. Coloque os tubos ultracentrífugos em um rack no lado de saída da bomba peristáltica multicanal. Usando uma pipeta sorológica, distribua cuidadosamente 10 mililitros de vírus clarificado em cada tubo de ultracentrífuga.
Em seguida, transfira 22 mililitros da fração de iodixanol a 15% para um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Coloque os capilares do lado direito da bomba no tubo e ligue a bomba. Pare a bomba.
Quando a fração de iodixanol atingir a extremidade dos capilares no lado de saída da bomba, insira um capilar de saída em cada tubo de ultracentrífuga com vírus clarificado e ligue a bomba. Pare a bomba quando a última da fração de 15% estiver prestes a ser levada para os capilares de entrada. Em seguida, transfira 22 mililitros da fração de iodixanol a 25% para o tubo cônico de 15 mililitros.
Depois de ligar a bomba, deixe toda a fração ser levada para os capilares de entrada e pare a bomba. Se necessário, adicione mais da fração de 60% e encha cada tubo até que o lisado faça uma cúpula por cima, mas não transborde. Pare a bomba e remova cuidadosamente o capilar de saída.
Tampe o tubo ultracentrífugo com um espaçador e carregue-o em um rotor tipo 70 TI. Após a centrifugação, prenda o tubo da ultracentrífuga a um suporte de suporte. Usando um lenço sem fiapos, remova a tampa do tubo de ultracentrífuga.
Em seguida, conecte uma agulha calibre 20 a uma seringa de 5 mililitros e penetre na parede do tubo ultracentrífugo com a agulha cerca de 3 mililitros abaixo da interface de iodixanol de 40 e 60%. Aspirar lentamente a interface e parte da fração de 40%. Segurando um dedo sobre a parte superior aberta do tubo de ultracentrífuga, puxe a seringa e transfira a fração aspirada de AAV para um tubo cônico de 50 mililitros.
Finalmente, diluir a fração viral aspirada duas vezes em tampão de lise AAV para um volume de 40 mililitros. Depois de lavar um tubo peristáltico, carregar 20 mililitros da fração AAV diluída em um novo tubo ultracentrífugo para a segunda rodada de fracionamento.
