Para começar, organize todos os materiais necessários para a passagem de enteróides intestinais humanos, ou HIEs, para a plataforma de trabalho. Misture os HIEs com a matriz de cultura 3D reduzida pelo fator de crescimento. Semeie a mistura em uma placa de 24 poços com três gotículas de 10 microlitros de matriz de cultura 3D por poço e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 350 microlitros do meio de crescimento HIE. Após sete dias, colete HIEs de quatro poços em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugue os HIEs a 2000g por 40 segundos para remover os detritos.
Usando uma pipeta, remova a matriz de cultura 3D excessiva do tubo. Adicione 0,5 mililitros de PBS frio no tubo. Usando uma seringa de insulina de um mililitro, aplique turbulência física com seringas até 10 vezes para dissociar os HIEs.
Centrifugue os HIEs dissociados a 2000g por 40 segundos e remova suavemente o sobrenadante. Em seguida, coloque o tubo no gelo por aproximadamente três minutos. Adicione a matriz de cultura 3D reduzida ao tubo e misture-a com o pellet.
Semeie a mistura de HIEs na matriz de cultura 3D no centro de um prato redondo de 35 milímetros. Incube o prato a 37 graus Celsius por 20 minutos para solidificar a matriz de cultura 3D. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de crescimento organoide intestinal pré-aquecido ao prato e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
No terceiro dia, substitua o meio de crescimento por dois mililitros de meio de diferenciação pré-aquecido e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. No quinto dia, substitua o meio enteróide por dois mililitros de meio de diferenciação pré-aquecido e continue a incubação por 24 horas.
