Comece removendo o prato contendo HIEs diferenciados da incubadora. Para sincronizar o relógio molecular dos enteróides, adicione dois microlitros de dexametasona 100 micromolar ao prato e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Durante a incubação, defina a porcentagem de dióxido de carbonotage e temperatura do luminômetro para 5% e 37 graus Celsius, respectivamente.
Após a sincronização do relógio, reabasteça os enteróides com três mililitros de meio de diferenciação pré-quente contendo 200 D-Lúcifer micromolares. Coloque o prato em uma mesa de oito poços do luminômetro de incubação e cubra a mesa do prato de amostra com sua tampa. Coloque duas câmaras umidificadoras com lenço úmido ou esponja na parte superior da mesa do prato de amostra e feche a tampa da máquina.
No software de bioluminescência, clique na guia de condição para ajustar as configurações do número de pratos, tempo de medição, processamento em segundo plano e tipo de filtro. Em seguida, clique em OK para salvar as configurações. Para iniciar o experimento, clique na guia executar, seguida pelo botão Iniciar.
Em seguida, clique nas guias filtradas ou sem tendência de ruído bruto na parte superior da tela para observar os sinais dos dados selecionados. Após a gravação, clique no botão parar para interromper a execução. Vá para a guia de arquivo, selecione salvar como e salve os dados no formato Kronos.
Por fim, clique em arquivo e selecione exportar como formato Excel para exportar os dados para uma planilha. O registro de bioluminescência avaliou a ritmicidade circadiana de HIEs sob condições enriquecidas com células-tronco e indutoras de diferenciação. A análise rápida de transformada de quatro anos revelou que, sob condições de diferenciação, a bioluminescência da luciferase B MAL exibiu oscilações circadianas robustas com uma periodicidade média de 22,92 horas.
Em contraste, os HIEs demonstraram ritmos circadianos interrompidos em condições enriquecidas com células-tronco.
