Para começar, conecte a impressora 3D a um computador. Coloque uma seringa descartável de um mililitro com uma agulha nas abraçadeiras impressas em 3D. Use dois parafusos de soquete M8 para prender as braçadeiras ao redor da seringa.
Gire o parafuso de chumbo para elevar manualmente o êmbolo, criando uma folga de ar de dois mililitros na seringa. Para preparar culturas de vibrio cholerae, inocular as células em três mililitros de caldo Luria com 10 esferas de vidro estéreis. Cultivar as células em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius por cinco a seis horas.
Da mesma forma, inocular E.Coli em três mililitros de caldo líquido Luria. Após incubação noturna a 37 graus Celsius, inocular 200 microlitros da cultura em caldo fresco de Luria por três horas. Transfira a cultura para um tubo centrífugo de 10 mililitros.
Em seguida, centrifugar por cinco minutos a 644G à temperatura ambiente. Agora, retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 microlitros de caldo líquido Luria. Em seguida, carregue uma seringa vazia de três mililitros de plástico na bioimpressora 3D.
Conecte o êmbolo da seringa com o parafuso de chumbo. Retraia a seringa manualmente para transferir a folga de ar para permitir uma melhor movimentação do êmbolo. Fixe uma agulha romba de tamanho adequado à ponta da seringa.
Gire manualmente o parafuso para retrair o êmbolo da seringa e carregue a suspensão bacteriana na seringa. Para preparar a mistura de hidrogel granular, misture grânulos secos de ácido acrílico reticulado com 400 mililitros de caldo Luria-Bertani a 2%Lennox. Ajustar o pH para 7,4 com incrementos de 500 microlitros de hidróxido de sódio 10 molares e testar o pH em uma tira teste.
Use uma seringa de plástico estéril de 50 mililitros para transferir a mistura de hidrogel para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar a matriz a 161 G durante um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, use uma seringa de 30 mililitros para transferir o volume necessário da matriz para um recipiente onde ocorrerá a impressão.
Em seguida, coloque os recipientes de amostra com a matriz de hidrogel para os suportes na plataforma de construção da impressora. Inicie o software de impressão 3D. Clique no arquivo e, em seguida, pressione abrir arquivo para carregar um gcode pré-programado no software.
Insira o comprimento do movimento. Em seguida, mova os planos X, Y, Z para centralizar as cabeças de impressão no plano X/Y. Pressione o ícone inicial para reajustar o eixo Z.
Gire manualmente o parafuso lentamente para deprimir o êmbolo da seringa até que uma pequena quantidade da suspensão bacteriana seja vista na ponta da agulha. Limpe o excesso de suspensão com um lenço descartável estéril. Agora, baixe a cabeça de impressão a uma distância fixa no meio de hidrogel de qualquer recipiente de amostra.
Clique em imprimir para começar a imprimir. Quando a impressão estiver concluída, feche os recipientes de amostra. Descarte a seringa e a agulha adequadamente.
Limpe a impressora com etanol 70%. Para imagens de campo de visão grande, use uma câmera com uma lente de zoom anexada. Imagem das células logo após a impressão à temperatura ambiente.
Em seguida, transfira as amostras para uma incubadora a 37 graus Celsius. Diferenças no tamanho dos poros da matriz não parecem afetar a disseminação celular não modal. No entanto, as células modais se espalham mais rapidamente na matriz com poros maiores em relação aos poros menores.
A colônia de vibrio cholerae em matrizes de hidrogel com poros maiores se espalha através de plumas difusas lisas. As plumas difusas estavam ausentes nas células não-modais. A colônia em matrizes de hidrogel com poros menores se espalha apenas através de plumas ásperas semelhantes a fractais para células modais e não modais.
Observou-se que ambas as células se espalharam em taxas semelhantes nas primeiras 150 horas. No entanto, em períodos mais longos, algumas amostras exibiram taxas mais rápidas de disseminação. Observou-se diminuição da tensão de escoamento, dos módulos de armazenamento e dos módulos de perda no hidrogel após o experimento.
