Para começar, ligue o gabinete de fluxo de ar laminar, permitindo que ele se estabilize por três minutos. Limpe e higienize assepticamente as superfícies internas do gabinete usando os seguintes agentes de desinfecção. Depois de desinfetar qualquer material que entre no gabinete, coloque guardanapos e luvas de nitrilo no gabinete.
Em seguida, desligue o gabinete e exponha-o à luz ultravioleta por 15 minutos. Após a irradiação, reinicie o gabinete. Coloque os reagentes de design de primer em um refrigerador cheio de gelo.
Após higienizá-lo com etanol 70%, coloque o recipiente dentro do gabinete. Prepare a amplificação isotérmica mediada por loop, ou mistura LAMP, em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mililitro. Pipete a mistura para homogeneizá-la.
Em seguida, incube os tubos fechados em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, resfrie os tubos em um refrigerador de poliestireno cheio de gelo por cinco minutos. Após o resfriamento, coloque os tubos no gabinete de fluxo laminar.
Para completar a mistura LAMP, adicione quatro microlitros de DNA polimerase, seguidos por um microlitro de transcriptase reversa. Para realizar a detecção colorimétrica, adicione o azul de dihidroxinaftol. Após a adição do reagente, pipetar cada solução para misturar adequadamente os reagentes LAMP.
Em seguida, pipete 22 microlitros da solução em tubos de PCR, tomando cuidado para não criar bolhas. Para o controle negativo, adicione três microlitros de água de pirocarbonato dietílico a 0,1%. Manter de lado quaisquer tubos restantes para a adição de material genético.
Em seguida, remova todos os materiais do gabinete. Depois de higienizar as superfícies do gabinete com etanol a 70%, desligue-o. Em uma área separada, adicione três microlitros da amostra a cada tubo de PCR e pipete bem com uma micropipeta de 20 microlitros para homogeneizar completamente.
Antes de iniciar a reação colorimétrica, use uma câmera de alta qualidade para tirar fotos dos tubos de PCR. Agora, faça a reação usando um termociclador e um banho-maria. Para o termociclador, coloque os tubos no bloco de reação e configure o perfil térmico no equipamento.
Se estiver usando o banho-maria, coloque os tubos com segurança em recipientes circulares e, em seguida, coloque-os no banho-maria a 66.3 graus Celsius por 60 minutos. Após o tempo de reação, remova os tubos e armazene-os a quatro graus Celsius até o uso. Se uma reação colorimétrica foi realizada, capture imagens da PCR com uma câmera de alta qualidade.
Um gradiente de temperatura demonstrou que a temperatura ideal de fusão era de 66,3 graus Celsius. A concentração da enzima BST 3.0 foi otimizada para 3,2 unidades internacionais por microlitro. Para definir a estratégia colorimétrica, foram avaliados o vermelho de fenol em corantes vermelhos neutros.
No entanto, nenhuma mudança de cor foi observada após a amplificação. A padronização de diferentes concentrações de azul de hidroxinaftol foi realizada com a mudança ótima ocorrendo com 125 micromoles de azul de hidroxinaftol. As amostras amplificadas demonstraram uma mudança na cor de acordo com sua concentração.
A amplificação da amostra foi confirmada por eletroforese.
