Para começar, pegue uma micro lâmina de 18 poços de câmara de fundo de vidro, adicione 150 microlitros de hidróxido de sódio em cada poço da câmara e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remover a solução de hidróxido de sódio e lavar os poços três a cinco vezes com água deionizada, seguida de três lavagens com tampão contendo cloreto de cálcio 10 milimolares. Em seguida, adicione 15 microlitros de SUVs recém-preparados nos poços contendo 150 microlitros de tampão com cloreto de cálcio 10 milimolar.
Após 30 minutos de incubação em temperatura ambiente, lave os SLBs pelo menos sete vezes com um tampão que não contenha cloreto de cálcio. Para a funcionalização dos SLBs biotinilados com estreptavidina, adicione uma solução de estreptavidina. Em seguida, lave os SLBs pelo menos cinco vezes com tampão para remover o excesso de estreptavidina.
Em seguida, adicione b-disiLID a uma concentração final de um micromolar ao poço. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, lave o excesso de proteína com tampão pelo menos cinco vezes. Em seguida, adicione mOrange-Nano a uma concentração final de 200 nano molar.
Cubra a amostra com papel alumínio e mantenha no escuro. Em seguida, coloque a microlâmina sob o microscópio de fluorescência. Defina o laser de 552 nanômetros para visualizar mOrange-Nano.
A microscopia de fluorescência revelou mOrange-Nano padronizado nos SLBs funcionalizados com b-disiLID. Após a fotoativação, há um rápido aumento no sinal de fluorescência no canal laranja dentro da região de interesse. A fluorescência do mOrange-Nano aumenta após cada ativação da foto, satura em 120 segundos e depois diminui para os níveis de fundo nos 120 segundos seguintes.
