Para começar, pegue o tubo de GUVs recém-colhidos. Adicione a solução de estreptavidina e deixe descansar por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um micromolar de b-disiLID à solução de GUV.
Cubra a amostra com papel alumínio e mantenha-a no escuro. Pré-trate uma câmara de fundo de vidro de 18 poços com 150 microlitros de solução BSA por 10 minutos. Em seguida, remova a solução BSA e lave os poços três vezes com 150 microlitros de água.
Em seguida, adicione 145 microlitros de 200 nanomolares mOrange-nano em tampão ao poço. Adicione cinco microlitros de GUVs decorados com um b-disiLID à solução. Cubra a amostra com papel alumínio e espere aproximadamente 15 minutos para que as vesículas assentem.
Em seguida, coloque a microlâmina sob o microscópio confocal. Excite a amostra em 552 nanômetros para visualização mOrange. E a 638 nanômetros para DID nas membranas do GUV.
Os GUVs mOrange-nano não exibiram fluorescência no escuro. A intensidade de mOrange quantificada na membrana GUV mostrou recrutamento proteico rápido e eficaz com reversibilidade total.
