Para iniciar a análise de citometria de fluxo, primeiro defina o laser de 785 nanômetros para uma potência de cinco miliwatts para medições de campo escuro. Use uma lente de 60X com uma abertura numérica de 0,9. Em seguida, selecione a configuração de alta sensibilidade e defina a velocidade como baixa.
Para garantir a estabilidade do cordão de calibração, pressione o botão Reproduzir na caixa de fluidos e examine as imagens do cordão, que devem parecer nítidas e claras. Gere um novo gráfico de dispersão na caixa de espaço de trabalho selecionando Novo gráfico de dispersão. Em seguida, selecione a área no canal Campo claro que corresponde à intensidade do canal SSC e exclua os cordões de calibração que estão sendo executados simultaneamente na amostra.
Em seguida, pressione o botão Carregar e posicione um tubo contendo a amostra de lactobacilos no suporte. Na caixa Configurações de aquisição, insira o nome da amostra e especifique o local para armazenamento de dados. Defina o número de eventos a serem coletados, normalmente dentro do intervalo de 10.000 a 20.000 eventos.
Agora, inicie o processo de aquisição clicando no botão Gravar localizado na caixa Aquisição. O processo será interrompido após atingir o volume especificado de eventos. Pressione o botão Return para descarregar o tubo e removê-lo do suporte conforme solicitado na janela pop-up.
Depois de repetir o processo para todas as amostras, salve o modelo para manter a uniformidade de aquisição de dados. Para análise de dados, para carregar o arquivo bruto no software de análise, clique em Arquivo e abra o arquivo rif. Na janela aberta, selecione Usar Análise de Aquisição e clique em OK. Em seguida, para criar um histograma do quadrado médio da raiz do gradiente, clique no botão Novo histograma e escolha a população da aquisição a ser analisada.
No recurso Eixo X, selecione RMS de gradiente do canal Campo claro. Em seguida, coloque um portão para excluir eventos não focados clicando no botão Criar região de linha na área de análise. Crie um gráfico de dispersão da área versus a proporção clicando no botão Novo gráfico de dispersão na área de análise.
Selecione a população focalizada na janela Novo gráfico de dispersão. Em seguida, selecione a área do canal Campo claro para o recurso Eixo X. Escolha a proporção para o recurso Eixo Y.
Desenhe uma porta no gráfico de dispersão usando o botão Criar Retângulo com base no valor da área para a população de eventos agregados. Da mesma forma, desenhe outro portão para a população de solteiros e pequenos agregados. Salve sua análise de dados como um modelo clicando na guia Arquivo, escolhendo Salvar como modelo ast e abra o próximo arquivo de amostra no mesmo modelo para criar o arquivo de análise de dados.
Para medir a distribuição de tamanho agregado, comece plotando um histograma da área da população de eventos de agregação. Salve a análise de dados clicando no arquivo e selecionando a opção Salvar como modelo. Depois de salvar, abra o próximo arquivo de amostra no mesmo modelo para o arquivo de análise de dados.
Células únicas, pequenos agregados, grandes agregados e cadeias foram observados em LGG e L. paracasei, mas não foi possível distinguir entre cadeias e agregados maiores. Variações significativas nas características de agregação de diferentes cepas de LAB foram observadas em resposta a açúcares fermentáveis ou não fermentáveis.
