Incorporação de tecido ocular e crioseccionamento em composto de temperatura de corte ideal para imagens de fluorescência

Após a conclusão da crioproteção do olho de coelho, transfira-o de uma solução de sacarose a 30% para uma placa de dissecação de 100 milímetros. Sob um microscópio de dissecação, vire cuidadosamente o olho para remover o excesso de solução de sacarose da parte interna do olho. Usando um pano, limpe suavemente o excesso de solução de sacarose da parte externa do olho, encha um molde de incorporação descartável com temperatura de corte ideal ou composto OCT a uma profundidade de 0,5 a um centímetro.

Coloque o olho no molde de incorporação voltado para cima e preencha lentamente a parte interna do olho com composto OCT, evitando a formação de bolhas. Assim que o olho emergir no composto OCT e não tocar as superfícies internas do molde, envolva o molde de incorporação em parafina e armazene-o a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, coloque o molde de incorporação em uma placa de dissecação.

Se possível, remova suavemente o composto OCT do interior do olho com um lenço. Transfira o olho para um novo molde de incorporação preenchido com composto de OCT fresco. Em seguida, preencha o molde como feito anteriormente para garantir que o meio de incorporação final esteja livre de detritos ou imperfeições.

Rotule o molde para fins de orientação. Posicione o olho para cima no molde criogênico, de modo que o composto OCT reveste a retina interna. Use a cabeça do nervo óptico como um ponto de referência para determinar a parte superior do olho Coloque o molde de incorporação rotulado em gelo seco, garantindo que o olho não toque as superfícies internas do molde ou fique exposto ao ar.

Monte o bloco no criostato com a parte superior do olho voltada para cima e a parte inferior para baixo. Com a córnea e a íris restantes voltadas para a direita ou para a esquerda. Posicione uma lâmina nova paralela ao eixo vertical do olho para seccioná-la.

Depois de cortar as seções e secar durante a noite, coloque uma lâmina no freezer a 80 graus Celsius. As imagens de fluorescência de uma criossecção retiniana inteira do olho de coelho demonstraram uma camada de epitélio pigmentar retiniano pigmentada uniforme sem descolamento significativo da camada fotorreceptora sobrejacente. Uma imagem de campo claro da seção retiniana demonstra ainda mais a morfologia retiniana intacta de todas as camadas.