Para começar, pegue as amostras descongeladas de tecidos murinos infectados com Salmonella com uma pinça. Insira-o rapidamente no fundo de um molde de plástico contendo agarose líquida. Quando a polimerização estiver concluída, use um bisturi para abrir o molde de plástico pelos cantos.
Depois de colocar uma lâmina em um micrótomo, transfira a amostra com os dedos enluvados para uma caixa de amostra. Posicione a amostra sob o micrótomo de modo que a superfície superior da agarose fique no mesmo nível da lâmina do micrótomo. Mova o palco para colocar o cubo de agarose no centro do objetivo.
Clique no botão Slice no software do tomógrafo até obter uma fatia inteira intacta do cubo. Em seguida, centralize a lente objetiva na amostra de tecido nas direções x e y. Inicie o software do laser, ajuste o comprimento de onda para 800 nanômetros e ligue o laser.
Feche as portas do armário do microscópio. Em seguida, desligue todas as fontes de luz da sala. Ligue os PMTs e defina a tensão para 750 volts.
Agora defina o obturador do microscópio para automático. Em seguida, defina as tensões de V1 e V2 para 20 e 1.71, respectivamente. Ajuste o eixo z com o dispositivo z-piezo até atingir a superfície do tecido.
Corte várias fatias de 50 micrômetros de espessura. Em seguida, para encontrar as bordas da amostra, confine a área de imagem ao tecido com imagens mínimas da agarose circundante. Depois de desligar os PMTs, defina o comprimento de onda do laser para 800 nanômetros.
Use o ponto de laser para encontrar as coordenadas das bordas do tecido enquanto desloca o palco. Depois de confirmar as coordenadas, posicione o ponto do laser no centro frontal direito. Agora mude o comprimento de onda para 940 nanômetros.
Defina o obturador do microscópio para o modo automático e, em seguida, defina o volume do obturadortage para 20 para V1 e 1.71 para V2. Pressione a opção de configuração Mosaico 3D para iniciar a digitalização. Após a imagem, colete as seções de tecido do tanque de água. Para costurar as imagens do bloco, primeiro transfira os dados do servidor de tomógrafo para o computador Linux.
Abra o script MATLAB StepOneStitchingAndArchive. m e localize a pasta de origem. Alterne para a guia Editor e clique em Executar.
As informações de progresso serão exibidas na janela de comando. Encontre as imagens unidas na subpasta chamada stitchedimages_100 na pasta de origem. Compacte os dados brutos usando o comando tar e salve-os como um único arquivo com a extensão de nome de arquivo tar.bz2.
Para treinar a máquina de vetor de suporte, visualize as imagens costuradas. Abra uma imagem com o mesmo nome de arquivo de cada subpasta com Fiji. Mescle os três canais em uma imagem colorida e, em seguida, ajuste o brilho de cada canal até que sinais claros sejam vistos de bactérias e autofluorescência do tecido.
Observe o nível de intensidade máxima ajustado de cada canal. Em seguida, abra o script MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. Defina a pasta de origem e os nomes das imagens para treinamento, vá para a guia Editor e clique em Executar.
Quando uma caixa de diálogo solicitando limites de cores aparecer, preencha-a com os valores baseados na verificação manual anterior com Fiji. Selecione as regiões para plano de fundo e regiões de interesse de acordo com as caixas de diálogo. Gráficos aparecerão mostrando o quão bem o modelo foi treinado e perguntando se mais regiões precisam ser adicionadas.
Adicione mais regiões de interesse e fundo até que as bactérias possam ser claramente segmentadas. O processo de segmentação será executado automaticamente e o progresso poderá ser visto na janela de comando. Em seguida, abra as imagens do canal azul, que contém sinais de colágeno de segundo harmônico.
Dobre as imagens do primeiro canal dez vezes nos eixos x e y e salve as imagens reduzidas em uma nova pasta. Faça três réplicas de imagens reduzidas na mesma pasta. Para a visualização 3D, inicie o pacote de software de visualização Imaris na visualização Arena.
Agora abra o arquivo IMS ou TIF. Ajuste as representações de cores dos diferentes canais na janela de ajuste de exibição. Clique em Propriedades da imagem no menu Editar para definir manualmente os valores mínimo ou máximo e um valor para correção de gama.
Depois de ajustar a aparência da imagem, exporte a visualização atual usando a ferramenta Instantâneo. Use o ponteiro de navegação para localizar uma exibição e, em seguida, use mais Adicionar para adicionar quadros-chave. Use o ícone Animação para representar os dados 3D como um filme.
Pressione o botão vermelho de gravação para criar o filme e salve-o na pasta de destino desejada e no tipo de arquivo. Células individuais de Salmonella foram detectadas em órgãos inteiros de camundongos, como baço, fígado, linfonodos mesentéricos e placas de Peyer. A segmentação de bactérias fluorescentes foi confirmada por imuno-histoquímica.
As células hospedeiras foram coradas in vivo injetando um anticorpo em marcadores de superfície antes da perfusão.
