Para começar, coloque duas placas de 96 poços, uma calha de carregamento e ponteiras de pipeta multicanal dentro da coifa de PCR. Depois de rotular cada placa, gire a placa 1 180 graus para que os números das colunas fiquem de cabeça para baixo, deixando a placa 2 voltada para o técnico. Em seguida, despeje o tubo de cinco mililitros da mistura mestre MM qPCR preparada na calha de carregamento.
Use uma ponta de pipeta para garantir que toda a solução do tubo seja transferida. Prenda as pontas à pipeta multicanal, pressionando a base de cada ponta para garantir uma vedação firme. Usando pipetagem reversa, dispense a mistura principal em todas as colunas pares ou ímpares primeiro, alternando entre as duas placas.
Após o vórtice e centrifugação das tiras de PCR, disponha-as no suporte de tubos na ordem em que serão colocadas nas placas. Agora gire as duas placas 180 graus para que os números das colunas sejam invertidos em relação ao técnico. Use a pipeta multicanal para ressuspender as soluções nas tiras de PCR.
Usando pipetagem reversa, preencha as três primeiras colunas de cada placa com a tira de PCR A, alternando entre colunas pares ou ímpares, como a colocação da mistura principal. Usando uma pipeta de 200 microlitros ajustada para 90 microlitros, ressuspenda completamente o sétimo tubo de diluição padrão na tira de PCR S e encha da quarta à sexta colunas nas placas. Depois de encher as placas, bata-as suavemente na bancada para garantir que o líquido nos poços assente no fundo.
Em seguida, cubra a parte superior das placas com filmes de vedação, pressionando todas as bordas do filme com a ponta dos dedos para garantir uma vedação firme. Para misturar o conteúdo das placas, gire-as na parte superior do capô por 30 segundos. Em seguida, coloque as placas seladas no girador de placas por dois minutos com as aberturas do poço voltadas para o centro.
Agora coloque as placas no termociclador garantindo que os números das colunas sejam legíveis. Limpe a parte superior de cada placa com um lenço de papel limpo antes de fechar a parte superior do termociclador. Em seguida, clique no botão Iniciar execução no software do termociclador para ambas as máquinas.
Quando solicitado, insira um título para os arquivos de análise, que serão usados para rotular e rastrear os dados desse experimento.
