Coleta de LCR de camundongos com doença leptomeníngea para subsequente expansão do clone

Para começar, identifique as fêmeas de camundongos NSG imunodeficientes, com doença leptomeníngea ou LMD. Coloque um mouse anestesiado na mesa cirúrgica. Posicione o nariz do camundongo em um cone modificado em forma de L de um aparelho estereotáxico, garantindo que as narinas permaneçam desobstruídas.

Puxando a pele suavemente para a frente através das superfícies ventrais de ambos os pavilhões auriculares e, em seguida, fixe-a no cone do nariz com fita adesiva. Guie as pontas da tesoura cirúrgica para baixo a partir do pavilhão auricular através do osso occipital. Crie uma pequena incisão na linha média medindo de cinco a sete milímetros logo acima da concavidade palpada.

Com um par de pinças de ponta romba com pontas de um a dois milímetros, aplique pressão suavemente na cisterna magna. Introduza as pontas na posição fechada e abra-as enquanto exerce pressão para baixo na dura-máter. Continue a realizar a dissecção romba até que a membrana dural seja claramente discernível e os vasos sanguíneos associados sejam visíveis dentro da área exposta.

Agora mantenha a pinça aberta para retrair a musculatura circundante. Em seguida, coloque uma agulha de calibre 27 a 29 em uma seringa de um mililitro. Insira a seringa sob a dura-máter para visualizar o chanfro.

Retraia gradualmente o êmbolo da seringa para coletar o máximo de líquido cefalorraquidiano possível. Transfira o fluido para um tubo de microcentrífuga. Coloque-o imediatamente no gelo.

Centrifugar a amostra a 257 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de aspirar o sobrenadante, pipetar 500 microlitros de PBS estéril para o pellet celular. Centrifugar o pellet a 257 g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Descarte o sobrenadante e, em seguida, transfira o pellet para uma placa de 96 poços contendo meios condicionados por HMC.