Preparação de Meios Condicionados de Células Meníngeas Humanas (HMC) e Coleta de Líquido Cefalorraquidiano para a Cultura de Células Tumorais Circulantes

Para começar, pré-cubra um frasco T175 com Poli-L-Lisina. Colocar o balão numa incubadora a 37 graus Celsius durante uma hora. Agora use uma pipeta sorológica estéril para aspirar a solução de lisina.

Pipetar 30 mililitros de meio de cultura meníngeo completo contendo células meníngeas humanas para o frasco. Incube as células a 37 graus Celsius sob 5% de suplementação de dióxido de carbono. Quando as células atingirem aproximadamente 75% a 80% de confluência, colete e guarde o meio cultivado HMC em um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, adicione o meio de cultura meníngeo completo ao tubo na proporção de um para um. Finalmente, pipete os fatores de crescimento no tubo para criar o meio condicionado HMC. Para processar o líquido cefalorraquidiano, primeiro coloque-o em um tubo cônico de 15 mililitros no gelo para resfriá-lo.

Centrifugue o fluido em uma centrífuga pré-resfriada a 257 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Pipetar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular e fazer alíquotas em diferentes tubos. Agora adicione um mililitro de PBS ao pellet celular para resuspendê-lo.

Centrifugue as células a 1.500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante PBS, deixando cerca de 50 microlitros dele no fundo do tubo. Realize uma contagem de células com a suspensão celular antes de cultivar as células.

Vários fatores de crescimento foram regulados positivamente no meio cultivado com células meníngeas humanas.