Para começar, obtenha a região lombar da espinha dorsal do filhote em um prato contendo um meio de dissecção a frio. Usando um microscópio estéreo de dissecção e microtesoura, corte a espinha dorsal ao longo do eixo sagital. Com uma pinça reta, remova suavemente a medula espinhal da cavidade da espinha dorsal e retire cuidadosamente as meninges da região lombar isolada da medula espinhal, ou SC. Transfira e incube a região lombar SC isolada em meio de dissecção frio e fresco por 10 a 15 minutos.
Usando uma pipeta Pasteur de plástico, coloque o tecido na plataforma de corte do instrumento picador perpendicularmente à lâmina. Depois de remover o meio de dissecção residual, prossiga com o seccionamento automatizado do SC. Usando uma pipeta Pasteur, transfira as fatias e incube-as com meio de dissecção fresco em um prato de 35 milímetros por 15 minutos. Lave a superfície da inserção da membrana de cultura três vezes com meio organotípico, ou OM, e deixe um mililitro de mídia na parte inferior da inserção da membrana.
Examine as fatias sob o microscópio estéreo de dissecção e semeie o número desejado de fatias nas inserções de membrana condicionadas. Depois de ajustar a orientação das fatias e remover o excesso de meio, incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, transfira o inserto para uma nova placa de Petri e adicione um mililitro de OM fresco suplementado com GDNF na parte inferior do inserto da membrana.
Incube as fatias a 37 graus Celsius. No primeiro dia ex vivo, substitua o meio antigo por um novo OM. No terceiro dia, mude para o meio de enxerto suplementado com GDNF e adicione GDNF fresco ao meio todos os dias até o sétimo dia ex vivo. Para o resto da cultura de longo prazo, adicione GDNF somente quando o meio for alterado.
O ensaio de imunofluorescência de fatias organotípicas SC de camundongos cultivadas a longo prazo revelou uma ampla distribuição do marcador neurofilamento do citoesqueleto e do marcador neuronal nuclear RBFOX3, atestando sua condição saudável e identidade neuronal.
