Extração de tecido adiposo epididimal de camundongo e isolamento de células-tronco para citometria de fluxo e caracterização funcional

Para começar, coloque um rato sacrificado em um quadro de cortiça com o lado ventral voltado para cima. Usando uma pinça, levante a pele raspada no centro do abdômen e faça uma incisão com uma tesoura estéril. Corte a pele para separá-la do peritônio.

Em seguida, levante a camada peritoneal e corte-a. Com um novo conjunto de pinças e tesouras estéreis, segure, levante e corte suavemente todo o tecido adiposo epididimal localizado acima dos testículos. Colocar a gordura excisada num tubo cónico estéril de 50 mililitros contendo meio basal sobre gelo.

Em seguida, lave o tecido epididimal com PBS. Com uma pinça estéril, transfira o tecido adiposo epididimal para um tubo contendo 15 a 20 mililitros de solução digestiva. Corte o tecido em fragmentos com uma tesoura estéril.

Em seguida, incube os fragmentos de tecido a 37 graus Celsius por uma hora. Diluir a amostra em um volume igual de meio basal para inativar a colagenase. Centrifugar a suspensão a 250 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em um mililitro de meio basal. Em seguida, veja o poço de uma placa de seis poços contendo três mililitros de meio basal com células isoladas. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, adicione três mililitros de meio basal às células lavadas com PBS. As células extraídas do tecido adiposo apresentaram correspondências morfológicas de células-tronco mesenquimais.