Para começar, descongele o reagente de digestão enzimática celular a 37 graus Celsius por 30 minutos. Sob um microscópio de campo claro com ampliação de 10x, observe os organoides intestinais humanos tridimensionais diferenciados para garantir a saúde celular. Substitua o meio dos poços de uma placa de 24 poços contendo organoides diferenciados por 500 microlitros de solução de recuperação de células frias.
Pipete para cima e para baixo para liberar as células da membrana basal. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Incube o tubo no gelo por 10 minutos, pipetando para cima e para baixo a cada cinco minutos.
Centrifugar a suspensão celular a 400 g durante três minutos a quatro graus Celsius. Remover o sobrenadante do tubo sem perturbar o chumbinho. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de reagente de digestão de células enzimáticas pré-aquecidas, pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
Coloque os organoides por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. A cada 10 minutos, pipete todo o volume 10 vezes usando uma pipeta P1000 para ajudar a dissociar as células. Centrifugar a suspensão celular a 400 g durante três minutos a quatro graus Celsius e ressuspender o pellet num mililitro de meio de diferenciação.
Pipete rapidamente as células para cima e para baixo 50 vezes no gelo para dissociar os organoides em células únicas. Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 mícrons e colete o eluato em um tubo novo de 1,5 mililitro. Em seguida, filtre o eluato obtido através de um filtro de 70 mícrons em um filtro de ponta de 40 mícrons.
Adicione cinco microlitros de 0,4% de azul de tripano a cinco microlitros de suspensão de células e conte as células individuais viáveis usando a exclusão de azul de tripano. Diluir a amostra com meios de cultura de células para obter 1000 células por microlitro. Um total de 4.402 células únicas foram isoladas de organoides intestinais humanos tridimensionais ileais diferenciados, representando os tipos de células esperados, incluindo enterócitos absortivos e células secretoras.
