Para começar, prepare o reagente de digestão enzimática de células e PBS / EDTA para a digestão de organoides intestinais humanos. Sob um microscópio de campo claro, confirme o crescimento de organoides intestinais humanos tridimensionais diferenciados como monocamadas. Descarte os meios de cultura de células da cultura em monocamada e substitua-os por 100 microlitros de PBS/EDTA.
Depois de remover PBS / EDTA, adicione 100 microlitros de reagente de digestão de células enzimáticas quentes a cada poço. Coloque a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono e pipete todo o volume cinco vezes a cada 10 minutos por 20 a 30 minutos. Transfira um a dois microlitros de suspensão celular para uma lâmina de vidro a cada 10 minutos para avaliar a dissociação observando a porcentagem de células individuais.
Após a dissociação, combine três poços replicados por condição em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 700 microlitros de meio de diferenciação de cultura de células contendo 10 inibidores de ROCK micromolares e misture suavemente por pipetagem. Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 mícrons, coletando o fluxo em um tubo novo de 1,5 mililitro.
Filtre o fluxo obtido através de um filtro de 70 mícrons em um filtro de ponta de 40 mícrons. Adicione cinco microlitros de 0,4% de azul de tripano a cinco microlitros de suspensão celular e conte as células individuais viáveis. Diluir a amostra com meios de cultura de células contendo inibidor de ROCK para obter 1.000 células por microlitro.
Um total de 9.952 células individuais foram isoladas de organoides intestinais humanos intestinais diferenciados cultivados em placas de 96 poços.
