Para começar, colete amostras de biópsia de esôfago imersas em meio livre de soro de queratinócitos, ou KSFM. Substitua o KSFM por um mililitro de Dispase I e incube as biópsias por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, usando uma pipeta de 1.000 microlitros, aspire o Dispase sem tocar nas biópsias ou no pellet de detritos celulares.
Em seguida, enxágue as biópsias com DPBS. Depois de centrifugar as biópsias, use uma pipeta de 1.000 microlitros para aspirar o sobrenadante. Em seguida, adicione 500 microlitros de tripsina-EDTA às biópsias e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos enquanto agita a 800 rpm.
Em seguida, execute pipetagem repetida até obter uma suspensão unicelular. Usando a cabeça do êmbolo de borracha de uma seringa de tuberculina, filtre as células através de um filtro de células de 70 micrômetros. Em seguida, lave o coador com dois a quatro mililitros de inibidor de tripsina de soja.
Em seguida, filtre as células através de um filtro de células de 35 micrômetros com uma tampa de encaixe em um tubo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros. Depois de centrifugar a suspensão celular, use uma pipeta de 1.000 microlitros para aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular na matriz de hidrogel do extrato da membrana basal e forme gotículas de 40 microlitros em uma placa de cultura de células de suspensão pré-aquecida.
Em seguida, incube a placa sem meio por 20 a 30 minutos a 37 graus Celsius para garantir a solidificação das gotículas do extrato da membrana basal. Adicione KSFM pré-aquecido suplementado com 10 micromolares de Y27632. No nono dia, a estrutura multicamadas semelhante a uma cebola em um núcleo queratinizado em crescimento no centro do organoide foi observada.
