Depois de coletar feixes de gametas de hermafroditas e espermatozóides de espécies de corais gonocóricos, coloque-os em tubos rotulados de 50 mililitros. Coloque quatro microlitros de suspensão de esperma ativada em uma câmara de contagem Makler. Para avaliar a motilidade dos espermatozoides, adicione a concentração da amostra ativada.
Abra o arquivo de folha de dados automática do biobanco de corais e insira o fator de diluição do esperma usado para a avaliação da análise de esperma assistida por computador. Em seguida, insira as saídas de análise de esperma assistidas por computador para concentração de esperma, motilidade total e motilidade progressiva. Escreva a concentração de espermatozóides no tubo de amostra de esperma filtrado e transfira o tubo para a estação de trabalho de criopreservação.
Abra a folha de dados automática do biobanco de corais compartilhado e selecione a guia Criopreservação. Depois de verificar o rótulo do tubo de amostra de esperma, identifique a entrada correspondente verificando o ID da colônia. Usando uma pipeta sorológica, meça o volume da amostra de esperma desenhando-a e expelindo-a de volta para o mesmo tubo. Insira o valor na coluna E.Verifique a coluna calculada automaticamente 1 para a concentração de crioprotetor necessária e a coluna H para o volume de criodiluente a ser adicionado.
Inicie um cronômetro. E usando uma pipeta, adicione gota a gota o DMSO criodiluente com mistura suave e constante da amostra. Registre o tempo da edição criodiluente na coluna P.Leia a coluna K para determinar o número de frascos criogênicos a serem preenchidos.
Destampe os frascos criogênicos estéreis com código de barras e arrume as tampas em uma superfície estéril. Usando uma pipeta sorológica e uma pipetadora de alíquota, alíquota de um mililitro de amostras em frascos criogênicos com código de barras e frascos de recapagem. Coloque um frasco de termopar e todos os frascos de amostra cheios em um inserto de rack criogênico vazio em temperatura ambiente.
Em seguida, coloque os frascos criogênicos fictícios contendo 10% de DMSO em água do mar filtrada em slots vazios no rack criogênico. Insira o número da execução na coluna U da folha de dados automática e digitalize o número de série do rack criogênico na coluna V.Coloque o cursor na célula correta da coluna Z e digitalize o frasco do termopar, seguido por todos os tubos do frasco criogênico. Separe racks carregados e digitalizados para o restante do equilíbrio crioprotetor.
Encha o recipiente de resfriamento do rack criogênico com nitrogênio líquido até o nível necessário para resfriamento a aproximadamente 20 graus Celsius por minuto. Após o período de equilíbrio crioprotetor de 10 minutos, conecte a sonda do termopar ao registrador de dados e comece a gravar. Coloque suavemente o rack criogênico cheio no recipiente de resfriamento e aplique a tampa.
Registre a hora de início na coluna Q.Uma vez que o frasco do termopar indique 80 graus Celsius ou menos no registrador de dados, transfira a inserção do rack criogênico para um banho de nitrogênio líquido para extinguir as amostras. Remova os frascos criogênicos do rack e transfira-os para um transportador seco para transporte para o biobanco. Em Acropora millepora, as lâminas fixas da câmara de lamínula mostraram menos da metade das contagens de concentração de espermatozóides em comparação com a câmara de contagem de Makler.
A validação da câmara de contagem de Makler com microesferas de látex disponíveis comercialmente em uma concentração conhecida resultou em contagens consistentes com baixa variabilidade dentro da faixa esperada. Nenhuma diferença significativa foi observada nas concentrações pós-descongelamento de espermatozoides totais, móveis ou progressivamente móveis em amostras criopreservadas usando 20% ou 30% de DMSO como criodiluente.
