Para começar, semeie HEK293T células em uma fábrica de células de 10 camadas contendo meio DMEM com alto teor de glicose com 10% de FBS. Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius sob 5% de suplementação de dióxido de carbono durante a noite. Em seguida, alíquota de 350 mililitros de Opti-MEM em uma garrafa estéril de 500 mililitros.
Adicione o DNA plasmático para transfecção na garrafa e agite para misturar bem. Agora adicione 15 mililitros de solução PEI no frasco. Agite a mistura vigorosamente por 30 segundos para garantir uma mistura uniforme.
Depois de incubar a mistura em temperatura ambiente por 15 minutos, transfira-a para uma garrafa de um litro. Em seguida, adicione 700 mililitros de DMEM com baixo teor de glicose. Remova a fábrica de células de 10 camadas da incubadora e aspire a mídia em um recipiente de resíduos.
Pipete cuidadosamente a mistura de transfecto de DNA para a Fábrica de Células. Em seguida, coloque a Cell Factory de volta na incubadora por 72 a 96 horas. Após três a quatro dias, filtre o sobrenadante clarificado através de uma unidade de filtro de 0,45 micrômetro.
Adicione 500 mililitros de DPBS à Cell Factory para enxaguá-la. Centrifugar a 4 000 g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Com um sistema de vácuo e uma pipeta de aspiração, remova e descarte o sobrenadante.
Adicione 20 mililitros de tampão de lise AAV ao pellet e misture para ressuspender o pellet no buffer. Armazene a 80 graus Celsius negativos até a purificação. Agora adicione a solução de cloreto de sódio 40% PEG à solução AAV, fazendo a concentração final de até 8% PEG.
Coloque a mistura em um rotador orbital de baixa velocidade durante a noite a quatro graus Celsius. Centrifugar a solução a 4 000 g durante 30 minutos a quatro graus Celsius para precipitar o vírus. Pipetar o sobrenadante.
Em seguida, tinha de cinco a 10 mililitros de amortecedor de ressuspensão AAV HEPES para o pellet. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros para continuar a purificação a jusante. Em seguida, fixe uma agulha puntada de calibre 16 encaixada em uma seringa de 10 mililitros e sobreponha os gradientes de iodixanol preparados em um tubo de ultracentrífuga de polipropileno de topo redondo.
Com uma agulha de calibre 22, adicione cuidadosamente até 17 mililitros da solução AAV no topo do gradiente. Complete o tubo com tampão de diálise AAV. Sele os tubos com um selador elétrico.
Centrifugar os tubos a 350 000 g durante duas horas num rotor de titânio a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira-os para um suporte de tubo de ultracentrífuga. Agora use uma nova agulha de calibre 18 para transferir o vírus AAV para um de diálise.
Remova o ar do depois de injetar o vírus nele. Coloque uma barra de agitação no copo que contém o tampão de diálise AAV e transfira-a para uma placa de agitação. Em seguida, coloque o de diálise no tampão com uma bóia flutuante.
Use uma seringa de 10 mililitros para transferir o vírus do para uma unidade de filtro centrífugo. Centrifugar a 4 000 g durante 15 a 30 minutos a quatro graus Celsius. Colete o AAV concentrado da unidade de filtro.
Em seguida, enxágue o filtro com 300 microlitros de tampão de diálise AAV. Por fim, transfira a solução de enxágue para o AAV concentrado. Descobriu-se que o vírus AVV isolado tem uma pureza superior a 90%, tornando-o adequado para uso in vivo.
