Método de gradiente contínuo para purificação de ilhotas suínas

Para começar, defina uma bomba para uma vazão de 200 mililitros por minuto e carregue 125 mililitros de solução de gradiente de alta densidade no formador de gradiente contínuo e, em seguida, no processador da célula. Inicie a função de centrífuga do processador de células a 1.000 RPM. Libere o ar do sistema e reproduza-o com uma solução de gradiente de alta densidade.

Em seguida, adicione 125 mililitros de solução de gradiente de alta densidade e 130 mililitros de solução de baixa densidade ao formador de gradiente. Carregue 100 mililitros de suspensão de tecido digerido. Aumente a velocidade do processador da célula para 2.000 RPM por três minutos.

Para preparar 16 tubos cônicos de 50 mililitros para coletar a fração purificada das ilhotas, adicione 25 mililitros de meio RPMI a cada tubo e organize-os em ordem crescente. Recolher as fracções purificadas dos ilhéus nos tubos cónicos preparados. Para corar as ilhotas, colete alíquotas de 100 a 200 microlitros de cada fração purificada das ilhotas e avalie o conteúdo das ilhotas usando coloração DTZ em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Inspecione cada fração usando microscopia de luz a 4X, onde as ilhotas aparecerão de vermelho escuro a preto. Usando este protocolo, o isolamento das ilhotas pancreáticas foi realizado em três porcos. As imagens de campo claro mostraram ilhotas pancreáticas purificadas, que foram caracterizadas quanto à viabilidade usando coloração viva/morta.

A distribuição representativa do tamanho das ilhotas após o isolamento das ilhotas mostrou distribuição de tamanho em torno de 50 a 100 mícrons. Além disso, o rendimento e a pureza foram avaliados usando um contador de células de ilhotas, indicando isolamentos pancreáticos suínos eficientes.