Para começar, descongele a trombina e a aprotinina no gelo e coloque um frasco de fibrinogênio em banho-maria a 37 graus Celsius. Usando uma pipeta, homogeneize-os sob o capô. Em seguida, usando um alicate estéril, coloque as inserções nos poços de cultura, deixando pelo menos uma coluna ou linha vazia na placa.
Em um tubo de 0,25 mililitro, adicione primeiro os volumes necessários de fibrinogênio e aprotinina. Em seguida, adicione a trombina no tubo e lave rapidamente duas vezes sem criar bolhas. Desenhe todo o conteúdo do tubo.
Posicione a pipeta verticalmente acima do centro do inserto e lave suavemente uma mistura de reagentes sem gerar bolhas. Incube por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius para solidificação até que a mistura fique branca opaca. Para a semeadura de organoides, confirme ao microscópio que as micromassas formam massas celulares esféricas, com um coro compacto cercado por um halo de densidade mais baixa de progenitores tímicos iniciais.
Corte a ponta de um cone P200 e lave-o com uma solução antiaderente. Incline a placa para uma posição quase vertical e aspire as massas celulares do fundo do poço. Deposite delicadamente a massa no topo dos hidrogéis sem tocar no gel.
Verifique ao microscópio se não resta nenhum organoide nos poços das placas. Em seguida, adicione lentamente um quarto do volume do meio de cultura no topo do hidrogel sem tocá-lo e adicione os 3/4 restantes no fundo do poço. Adicione um mililitro de PBS aos poços de cultura vazios para manter a umidade na placa e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Os organoides formam estruturas esféricas a oblongas e ocasionalmente se fundem para formar estruturas maiores nos hidrogéis.
