Para começar, obtenha um camundongo SMARTA positivo para CD 45.1 de seis a oito semanas e injete-o com 200 microgramas de peptídeo LCMV GP 61-77 em 100 microlitros de meio RPMI por via intravenosa. Depois de adquirir os esplenócitos do camundongo, suspenda-os em 2% RPMI para atingir uma densidade celular de uma vez 10 elevado a oito células T por mililitro e coloque o tubo com as células no gelo. Dispense 50 microlitros de suspensão celular junto com 150 microlitros de tampão de coloração para cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços.
Centrifugue a placa de 96 poços a 800 G por um minuto a quatro graus Celsius e decanta cuidadosamente o sobrenadante. Vortex a placa e adicione 200 microlitros de tampão de coloração a cada poço. Depois de peletizar as células, ressuspenda-as e incuba-as com coquetel de anticorpos de superfície no gelo por 30 minutos no escuro.
Depois de lavar duas vezes, ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de coloração e transfira-as para um tubo de citometria de fluxo. Realize a análise de citometria de fluxo para verificar o status de ativação das células T positivas para SMARTA CD4. Em seguida, semeie uma vez 10 as seis células T positivas para SMARTA CD4 por poço em uma placa de 24 poços.
Gire as células a 800 G por três minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o meio sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de meio retroviral e oito microgramas de polibreno a cada poço. Spin transduzem as células a 800 G por duas horas a 37 graus Celsius.
Após descartar o meio retrovírus, incubar as células com um mililitro de RPMI a 10% pré-aquecido suplementado com interleucina 2. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugá-la. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células com 2% RPMI para atingir uma densidade celular de uma vez 10 elevado às oitavas células por mililitro.
Para avaliar a eficiência da transdução, alíquota de 50 microlitros de suspensão de células em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Incube-os no gelo com o coquetel de anticorpos de superfície, incluindo CD4, V alfa dois e anticorpo associado a tag vetorial. Lave as células e realize a citometria de fluxo conforme demonstrado anteriormente.
Em seguida, injete uma vez 10 das seis células T positivas para SMARTA CD4 CD4 CD 45.1 positivas em um camundongo receptor C57BL / 6 por via intravenosa, seguido por uma vez 10 nas seis unidades formadoras de placa de LCMV Armstrong no dia seguinte. Depois de adquirir os esplenócitos do camundongo, core-os para verificar os marcadores desejados. Para detectar fatores transcricionais, incube as células com 200 microlitros de 2% de paraformaldeído em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.
Finalmente, realize citometria de fluxo para detectar fatores no estágio inicial da infecção aguda por LCMV. No terceiro dia após a infecção, foi encontrada uma bifurcação equilibrada de células T auxiliares foliculares e células T auxiliares 1 entre as células T positivas para MIGR1 SMARTA CD4. Uma diferenciação direcionada de células T auxiliares foliculares predominantes e níveis aumentados de expressão de BCL6 foram observados em células T positivas para MIGR1, BCL6, SMARTA CD4.
