Para começar, obtenha embriões de peixe-zebra anestesiados em tampão E3. Depois de selecionar os embriões com a fluorescência desejada, visualize seus batimentos cardíacos sob um microscópio estéreo de campo claro. Usando uma pipeta de transferência de ponta larga, retire até três embriões e transfira-os para uma placa de imagem de vidro inferior.
Sob um microscópio estéreo, usando uma pipeta, substitua o meio ao redor dos embriões por uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 1%. Usando uma ponta cônica fina de plástico presa a uma agulha de provocação, empurre suavemente cada embrião para o fundo da placa de imagem e oriente o lado dorsal para ficar de frente para o vidro. Monte o embrião em um microscópio confocal invertido.
Depois de definir os parâmetros de aquisição de lapso de tempo, adquira as imagens. Abra o software conversor de arquivos Imaris e arraste e solte os arquivos na área de entrada. No menu Saída, designe o local para os arquivos convertidos.
Clique no tamanho do voxel definido para verificar e pressione o botão Iniciar tudo para iniciar a conversão do arquivo para o formato IMS. Uma vez iniciado, deixe o software de análise começar na arena. Clique em Observar pasta para abrir o arquivo convertido anteriormente.
Depois que o arquivo for carregado no software, clique na visualização Slice para rolar pela pilha z. Usando o controle deslizante na barra de ferramentas Fatiar, meça os diâmetros das células depois de desenhar o diâmetro das células selecionadas com o ponteiro. Clique e arraste o mouse para desenhar segmentos que abrangem o núcleo da célula e observe o comprimento do segmento desenhado na barra de ferramentas de medida situada à direita da área de exibição.
Para detectar automaticamente as células, volte para a vista 3D e clique no ícone Ponto na barra de ferramentas do objeto para adicionar um novo objeto Pontos na lista Objeto e abra o Assistente de Criação Automática de Pontos. Na primeira etapa do Assistente, escolha a opção de segmentar apenas uma região de interesse. Em seguida, ative a opção Rastrear pontos ao longo do tempo para calcular os dados de rastreamento, bem como as Estatísticas de objeto-objeto para permitir a comparação entre pontos e expandir o intervalo de dados.
Clique no botão Avançar no canto inferior direito da janela do Assistente. Especifique uma região de interesse, ou área ROI, que envolve o tectum óptico do embrião. Clique e arraste as pequenas setas brancas presentes em cada face para modificar o tamanho do ROI.
Em seguida, estenda-o a todos os quadros gravados com ajustes de intervalo de tempo. Em seguida, selecione um canal de origem e defina a medição do diâmetro da célula obtida anteriormente como o diâmetro XY estimado. Ative a opção Subtração de fundo e clique em Avançar.
Insira os valores de limite de intensidade diretamente nas caixas de limite inferior e superior para garantir a detecção de todas as células. Clique em Área de Visualização para observar todas essas mudanças em tempo real. Quando estiver satisfeito, clique em Avançar para validar o limite de qualidade selecionado e clique em Área de exibição para visualizar pontos que satisfaçam esses dois parâmetros sobrepostos no canal de origem.
Em seguida, selecione o Movimento Autoagressivo como o algoritmo de rastreamento para rastrear células que têm um movimento mais ou menos contínuo. Observe o movimento dos pontos entre dois quadros para julgar a maior distância que uma célula se move entre dois pontos de tempo e insira um número estimado no campo de distância máxima. Para definir o tamanho máximo do intervalo, se o intervalo entre os quadros for inferior a 60 segundos, use um tamanho de três e, para intervalos de tempo mais longos, aumente o mesmo.
Ative as lacunas de preenchimento com todos os objetos detectados para diminuir o limite de detecção e conectar faixas. Em seguida, clique em Avançar e deixe o software gerar automaticamente faixas para todos os pontos gerados anteriormente. Se as trilhas obtidas forem numerosas ou fragmentadas, retorne ao Assistente de Criação com o botão Anterior e ajuste a distância máxima definida anteriormente.
Para excluir as faixas com menos de três a oito minutos, insira o valor diretamente no campo de dados para o limite inferior do filtro de duração da faixa. Clique em Avançar para validar o filtro e vá para o Assistente de Criação. Remova manualmente as trilhas geradas pelos macrófagos da pele da análise para se concentrar na micróglia parenquimatosa cerebral.
Usando o Editor de Trilhas, corrija manualmente outros possíveis erros nas faixas. À direita da área de visualização, ative o botão círculo Selecionar modo e destaque as trilhas que requerem modificações ou ajustes. Uma vez selecionada a faixa problemática, usando os botões Conectar e Desconectar, edite-a para representar corretamente os movimentos da célula.
Com o Editor de Trilhas, selecione Modo de Seleção de Círculo para excluir pontos únicos duplicados. Se estiver usando o repórter de microglia com outras células parenquimatosas marcadas com fluorescência, ajuste o diâmetro XY estimado e a distância máxima para a nova população de células. Modifique a entrada do canal de origem para a imagem.
Por fim, usando a guia Estatística, extraia as estatísticas de rastreamento desejadas. Clique no botão Configurações e selecione as estatísticas para o cálculo de cada objeto de ponto ou objeto de superfície criado anteriormente. O cérebro do peixe-zebra embrionário foi fotografado em sua totalidade, e a localização dos neurônios em relação à microglia foi visualizada.
Os dados espaciais obtidos usando este protocolo retratam a velocidade média das células microgliais, a distância média que percorrem em uma hora, seu deslocamento quadrado médio e sua distribuição no espaço em diferentes momentos.
