Para começar, coloque o camundongo fêmea experimental em uma plataforma de trabalho. Por via intraperitoneal, administrar 7,5 unidades internacionais de gonadotrofina sérica de égua grávida por volta das 20:00 do primeiro dia. Após 48 horas, injete por via intraperitoneal 7,5 unidades internacionais de gonadotrofina coriônica humana.
Divida a tampa de um prato de cultura de células em metades superior e inferior. Na metade superior, coloque quatro a seis gotículas de cinco microlitros cada de PVP para a colocação de espermatozoides. Adicione 8 a 10 gotículas de cinco microlitros cada de meio M2 na metade inferior para o procedimento ICSI.
Cubra as gotículas de PVP e M2 com aproximadamente três mililitros de óleo mineral. Depois de isolar a cauda do epidídimo do camundongo macho sacrificado, seque-o suavemente em gaze esterilizada. Abra o epidídimo da cauda e aperte suavemente, usando uma pinça para liberar os espermatozoides, coletando-os em tubos de fluido tubário humano pré-equilibrados.
Enxágue o epidídimo da cauda no meio de fluido tubário humano pré-aquecido. Coloque o tubo descoberto a 37 graus Celsius e 5% de incubadora de dióxido de carbono para capacitação de espermatozoides. No quarto dia após a injeção de gonadotrofina coriônica humana, coloque o camundongo fêmea sacrificado sob um microscópio de dissecação.
Usando uma agulha de calibre 25, rasgue a ampola do oviduto para liberar vários complexos de oócitos cumulus. Após a capacitação, sonicar 100 microlitros do esperma por cinco segundos para separar as cabeças das caudas. Encha a agulha de micromanipulação com o fluido operacional, garantindo que a porção preenchida meça 0,5 centímetros dentro da agulha.
Instale a agulha no braço direito do micromanipulador e prenda-a apertando a tampa de retenção. Em seguida, instale uma pipeta de micromanipulação de ponta chata no braço esquerdo do micromanipulador. Posicione a agulha de injeção e a pipeta de retenção no campo de visão do microscópio.
Sob um microscópio de polarização, determine a posição do fuso metafásico dentro do oócito para garantir que o aparelho do fuso não esteja no lado da injeção. Ao entrar em contato da agulha de injeção com a zona pelúcida, ativar pulsos piezoelétricos com intensidade de cinco e frequência de um, criando uma perfuração na zona pelúcida e permitindo a passagem da agulha de injeção. Usando pulsos piezo de intensidade um e frequência um, crie um pequeno poro na membrana plasmática, garantindo que a cabeça do espermatozóide seja injetada no ooplasma.
Usando uma pinça atraumática, exteriorize cuidadosamente os ovários, ovidutos e útero da rata pseudo-grávida anestesiada. Faça uma pequena incisão em ângulo ascendente usando a ponta de uma agulha de seringa na parede uterina abaixo da junção uterotubária, evitando vasos sanguíneos. Insira suavemente o oviduto de dois a três milímetros através do pequeno orifício.
Usando o método ICSI, uma taxa de fertilização de 89,57% foi alcançada em camundongos, com 87,38% dos zigotos avançando para o estágio de embrião de 2 células dentro de 24 horas após o ICSI. A taxa de natalidade de filhotes vivos após a transferência de embriões foi observada em 42,5%Não houve flutuação significativa nos níveis aleatórios de glicose no sangue entre camundongos nascidos naturalmente e camundongos ICSI. No entanto, camundongos ICSI machos exibiram consistentemente níveis elevados de glicose no sangue em jejum, sugerindo homeostase de glicose prejudicada.
Nos testes de tolerância à glicose, foram observadas diferenças significativas nos níveis de glicose no sangue entre ICSI machos e camundongos controle, enquanto nenhuma diferença foi observada em camundongos fêmeas. No rastreamento do peso corporal, camundongos ICSI machos e fêmeas exibiram um fenótipo de excesso de peso em comparação com os controles.
