Depois de realizar a imuno-histoquímica nos tecidos FFPE, faça a imagem das seções usando o gerador de imagens de patologia digital. Inicie o software para realizar a desmistura espectral das imagens anotadas. Selecione Arquivo, clique em Abrir imagem e escolha os arquivos QPTIFF para carregar as imagens no software.
Permita que os carimbos marcados como projetos informados sejam carregados no projeto. Carregue os arquivos QPTIFF preparados para a compensação de autofluorescência. Selecione a autofluorescência na ferramenta de imagem para desenhar uma linha na imagem a partir do slide não corado através de estruturas autofluorescentes como eritrócitos e colágeno para compensar a autofluorescência.
Em seguida, navegue até a seção Editar marcadores e cores. Atribua nomes de marcadores que correspondam ao fluoróforo Opal e ajuste as configurações de cor para sua opção preferida. Selecione Preparar tudo localizado no canto inferior esquerdo da interface para iniciar a desmistura de fluoróforos.
Examine todas as imagens para verificar a visibilidade de todos os sinais e a conclusão bem-sucedida do processo de desmixagem. Selecione o ícone do globo ocular para desligar e ligar todos os marcadores, um por um, para verificar a qualidade. Agora navegue até a guia Exportar e crie um novo diretório de exportação vazio clicando no botão Procurar localizado no diretório Exportar.
Selecione imagem composta e imagens componentes TIFF de várias imagens na guia imagens a serem exportadas. Navegue até a guia Análise em lote encontrada verticalmente à esquerda para processamento em lote de slides e selecione criar diretórios separados para cada item nas opções de exportação. Para adicionar slides para análise, selecione arquivos QPTIFF no botão Adicionar slides e carregue-os na análise em lote.
Selecione Executar para iniciar o processamento em lote de slides. Crie uma nova pasta contendo apenas os arquivos de componentes da mistura espectral, garantindo que a estrutura hierárquica de pastas permaneça intacta. Inicie todo o software visualizador de slides.
Clique em Criar projeto no lado esquerdo e crie ou selecione uma nova pasta vazia com um nome apropriado. Em seguida, clique em Automatizar e escolha Mostrar editor de script. Copie e cole o script existente e modifique o local para direcioná-lo para a pasta que contém todos os arquivos do componente do slide.
Selecione Executar para iniciar o processo de costura em lote de slides e, em seguida, permita que ele seja concluído. Agora, mova os arquivos TIFF do OME gerados recentemente para o projeto QuPath e salve-os como um novo projeto. Quando uma nova janela aparecer, selecione definir tipo de imagem como fluorescência e clique no botão Importar.
Navegue até o menu à esquerda, selecione uma amostra da lista e clique duas vezes para abrir a amostra escolhida. Ajuste a intensidade dos canais clicando no ícone Contraste para aumentar a visibilidade. Selecione todos os canais e opte por redefinir.
Certifique-se de que a autofluorescência esteja desativada. Para desenhar uma região de interesse ou ROI para o tumor, clique no ícone de contraste novamente e selecione Mostrar escala de cinza. Depois disso, selecione o canal do marcador tumoral e ajuste a intensidade para obter a visibilidade ideal.
Clique na ferramenta pincel para desenhar um ROI ao redor do tumor. Clique em uma ferramenta e ajuste o ROI enquanto pressiona a tecla alt para suavizar o ROI de fora. Quando terminar, mescle todas as partes separadas do tumor no mesmo ROI.
Clique com o botão direito do mouse na anotação de ROI na lista à esquerda, selecione Definir propriedades e forneça um nome adequado. Por exemplo, Tumor. Expanda o ROI para a margem invasiva da região do tumor selecionando Objetos, depois Anotações e Expandir Anotações.
Escolha o tamanho desejado para o raio de expansão. Selecione remover interior e restrinja ao pai. Clique no ícone de contraste, selecione o canal de autofluorescência e ajuste a intensidade para uma visibilidade ideal.
Clique na varinha e ajuste o ROI enquanto pressiona a tecla alt para suavizar o ROI do lado de fora e remover qualquer plano de fundo que não deva fazer parte desse ROI. Clique com o botão direito do mouse na anotação na lista à esquerda. Em seguida, selecione Definir propriedades para atribuir um nome adequado, como margem invasiva ou IM ao ROI.
Se desejar, mude sua cor. Para exportar as anotações, navegue até a opção Arquivo, clique em Dados do objeto, Exportar como GeoJSON e selecione Exportar todos os objetos. Continue com a seleção padrão em exportar como coleção de feição e salve-a em um local preferencial.
