Após o crescimento de células endoteliais na placa de 96 poços, remova-a da incubadora e confirme a confluência usando um microscópio invertido. Passe o prato em uma pia para remover a mídia completa e seque a parte superior do prato com uma toalha de papel. Adicione o tampão de ensaio HBSS HEPES mais a solução de probenecida a um reservatório de solvente de pipeta multicanal de 50 mililitros.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de tampão de ensaio a cada poço e deixe as células descansarem por cinco minutos. Em seguida, agite a placa para remover o tampão do ensaio. Adicione o buffer de download a um reservatório de solvente de pipeta multicanal de 50 mililitros separado.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitros do tampão de carregamento de corante a cada poço da placa de ensaio. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 45 minutos. Após a incubação, observe a placa sob um microscópio de fluorescência para confirmar a absorção do corante.
Agite a placa para remover a solução de corante. Lave as células duas vezes com 50 microlitros do tampão de ensaio HBSS HEPES mais solução de probenecida em cada poço. Agite a placa para remover o tampão do ensaio.
Adicione 92 microlitros de tampão de ensaio HBSS HEPES a cada poço e, novamente, visualize as células com um microscópio de fluorescência para garantir que o excesso de corante tenha sido totalmente removido e que as células permaneçam aderentes. Usando uma pipeta multicanal, adicione dois microlitros das soluções antagonistas e veículo aos poços apropriados. Depois de ligar o leitor de placas, ajuste a temperatura para 37 graus Celsius e incube a placa por 15 minutos.
Meça a fluorescência de fundo nas colunas um e dois, realizando cinco varreduras por poço. Ejete a placa do leitor de placas e, em seguida, de uma tira de PCR de 8 tubos, adicione rapidamente seis microlitros de solução agonista usando uma pipeta multicanal a cada poço nas colunas um e dois. Meça a mudança na fluorescência à medida que ocorre a mobilização de cálcio nas células.
Realize 20 varreduras de cada poço. O ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais demonstrou que poços de controle positivo sem antagonista exibiram um rápido aumento na fluorescência. Os poços com altas concentrações de antagonistas apresentaram alteração mínima na fluorescência, semelhante aos poços de controle negativo sem agonista.
