Para começar, configure um microscópio fluorescente para imagens. Insira uma lâmina totalmente corada com seções de tecido de coloração imunológica. Depois que o objetivo for definido, pressione o botão ao vivo e concentre-se na amostra.
Use o ícone de dimensionamento automático para avaliar se os canais estão adequadamente saturados com sinal. Depois de finalizar as configurações do microscópio, carregue o microscópio com as lâminas de controle de cor única. Concentre-se abaixo da amostra e pressione a opção iniciar no menu Z-Stack para iniciar a configuração de um Z-Stack.
Em seguida, foque acima da amostra e pressione a opção final. Para compensação de fluorescência das imagens, abra uma das imagens de controle individuais. Observe as janelas de escala de cinza para cada canal para um sinal em um canal inadequado.
Para remover o sangramento, insira manualmente os números na matriz e pressione aplicar para testar se ele foi removido adequadamente. Em seguida, monte todos os valores de cada controle em uma única matriz. Aplique esta matriz a uma amostra totalmente corada.
Inicie o software ilastik e abra o arquivo tiff dos tecidos. Clique na guia de treinamento e use a ferramenta pincel para destacar células individuais nas imagens. Certifique-se de destacar as células de forma que o interior e a membrana celular sejam incluídos.
Em seguida, use o rótulo dois para destacar tudo o que não são as células de interesse. Agora inicie o software três e abra uma imagem IMS do tecido contendo todas as manchas fluorescentes. Escolha a opção de máscara sobre núcleos como o canal de origem para detecção de núcleos.
Em seguida, selecione a opção avançada para dividir núcleos por pontos de semente. Defina um valor para o diâmetro do núcleo. Examine a imagem em busca de várias células fundidas ou células ausentes.
Em seguida, clique no objeto de células criadas, seguido pela guia de criação e, em seguida, na opção armazenar parâmetros para lote para salvar as configurações de uso. Inicie o Anaconda e, em seguida, inicie o JupyterLab no Anaconda. Abra o arquivo de codificação suplementar 1 e pressione executar todas as células ou executar células selecionadas no menu de execução.
Quando um prompt for exibido, insira o diretório de arquivos para os valores fluorescentes exportados. Em seguida, insira o diretório de arquivos para qualquer local adequado para salvar os arquivos processados. Execute a próxima seção do código para anotar os dados com os nomes de cada canal.
Depois que uma estratégia de gating for estabelecida, clique com o botão direito do mouse em população no menu e escolha exportar. Exporte os parâmetros como um arquivo csv com os cabeçalhos incluídos. Inicie o JupyterLab no Anaconda novamente.
Em seguida, abra o script no arquivo de codificação suplementar 2 e execute o código. Quando solicitado a inserir o local do software para o arquivo, insira o diretório de arquivos dos arquivos csv exportados. Em seguida, quando solicitado a adicionar o local de saída, escolha um diretório de arquivos de sua escolha e certifique-se de que o diretório de arquivos inclua o nome do arquivo no final.
Execute o restante do código. Agora copie o texto em um arquivo txt e abra o arquivo ims correspondente no software três. Clique no objeto de célula no arquivo.
Alterne para a guia de estatísticas, cole o texto na barra de pesquisa e comece a pesquisa. Todas as células de interesse agora serão destacadas. Corantes fluorescentes espectralmente sobrepostos foram efetivamente separados no tecido que foi corado com vários corantes.
A separação dos corantes diferenciou claramente os diferentes tipos de células no tecido linfático. O aprendizado de máquina definido pelo usuário foi usado para separar as células, mesmo quando compactadas.
