Para começar, adicione 1,5 mililitros de etanol a 70% a 30 miligramas de partículas de tungstênio de 0,7 micrômetro em um microtubo. Centrifugue a mistura a 13, 200G por 15 minutos. Adicione 1,5 mililitros de água estéril às partículas, depois vórtice e centrifugue novamente.
Depois de descartar o sobrenadante, adicione 500 microlitros de glicerol estéril a 50% às partículas de tungstênio. Para revestir as partículas, primeiro adicione cinco microgramas de um plasmídeo de dois mícrons e 15 microgramas de um plasmídeo bacteriano contendo a sequência mitocondrial em um microtubo colocado no gelo. Adicione 100 microlitros da suspensão de partículas de tungstênio ao tubo e ao vórtice.
Em seguida, adicione quatro microlitros de espermidina de um molar e vórtice novamente. Agora pipete 100 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 molar gelado no tubo. Depois de fazer um breve vórtice da suspensão, incube-a no gelo por 10 minutos.
Centrifugue as partículas de tungstênio a 13.200G por 30 segundos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as partículas em 200 microlitros de etanol a 100% a menos 20 graus Celsius. Finalmente, ressuspenda as partículas de tungstênio em 60 a 70 microlitros de etanol 100% à temperatura ambiente.
Para preparar os materiais biolísticos, coloque seis suportes de macrotransportadores esterilizados em uma placa de vidro estéril. Use uma pinça estéril para inserir os macrotransportadores em cada um dos seis suportes de macrotransportadores. Pipete 10 microlitros de partículas de tungstênio codificadas por DNA em cada superfície macrotransportadora e distribua uniformemente por toda a superfície com a ponta da pipeta.
Inocular a cepa receptora de levedura rho zero em dois mililitros de meio YPR. Cultive a cultura durante a noite a 30 graus Celsius em uma roda giratória. No dia seguinte, transfira 300 microlitros da cultura para um tubo contendo 30 mililitros de meio YPR fresco.
Coloque a cultura em uma coqueteleira rotativa por duas noites a 30 graus Celsius e 200 rotações por minuto até que a cultura esteja saturada. Centrifugue as células de levedura a 600G por cinco minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células em 600 microlitros de meio YPD após descartar o sobrenadante.
Agora use uma alça de vidro estéril para espalhar 100 microlitros da suspensão de células de levedura em uma placa média de bombardeio sólido. Depois de espalhar todas as culturas, incube as placas em temperatura ambiente por uma a três horas antes do bombardeio.
