Para começar, coloque um olho de rato formal e fixo em um pedaço de papel encerado sob um microscópio de dissecação. Com um par de micro fórceps, segure os restos do músculo e do nervo óptico. Em seguida, oriente o olho de forma que a córnea fique voltada para um lado.
Agora use uma lâmina cirúrgica para fazer uma incisão de um a dois milímetros de comprimento atrás e paralela ao limbo. Aplique uma força para baixo com a lâmina enquanto mantém o olho no lugar até que o segmento anterior se separe da extremidade posterior. Em seguida, descarte o segmento anterior e a lente.
Transfira o segmento posterior para um prato de seis centímetros cheio de PBS. Use uma espátula micros para retirar a retina enquanto segura simultaneamente o nervo óptico com uma micropinça. Para enxaguar a retina, transfira-a para um poço de uma placa de 12 poços que possui seis poços cheios de água bidestilada duplamente.
Use uma pipeta P1000 para pipetar cuidadosamente a água para cima e para baixo adjacente à retina enquanto sopra a água para causar agitação suave. Em seguida, use uma pipeta de vidro invertido para transferir a retina para o segundo poço. Para digerir a retina, transfira a retina enxaguada para uma solução de tripsina em uma placa de 12 poços com uma pipeta de vidro invertido.
Centralize uma ponta de pipeta P200 embebida em tripsina no nervo óptico. Em seguida, pipete suavemente toda a rede vascular para cima e para baixo para dissociar o tecido não vascular. Agora, use uma pipeta de vidro invertido pré-enxaguada em tripsina para transferir a vasculatura retiniana para um poço contendo água bidestilada em uma placa de seis poços.
Gire a placa e, em seguida, pipete a vasculatura para cima e para baixo com uma pipeta de vidro enxaguada com tripsina invertida para remover qualquer tecido não vascular residual. Transfira cuidadosamente a vasculatura da retina para o centro da região marcada em uma lâmina de microscopia de superfície carregada. Em seguida, use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente o excesso de água de uma borda.
Coloque a lâmina em um gabinete de biossegurança próximo à parte frontal para permitir que a água residual evapore. Quando a vasculatura estiver quase seca, transfira-a para um microscópio de contraste de fase. Use uma pipeta P200 para adicionar lentamente água bidestilada em um lado da região marcada para reidratar cuidadosamente a vasculatura.
A fixação da vasculatura retiniana isolada resultou em tecido estruturalmente robusto e suficientemente durável, adequado para medições de AFM. Em contraste, os vasos retinianos isolados de olhos não fixos ou brevemente fixos tornaram-se fragmentados e colapsaram.