Para começar, coloque o meio de imagem pré-aquecido e as placas de microscopia estéreis com superfícies de vidro de cobertura revestidas ou não revestidas em uma plataforma de trabalho. Depois de remover o meio ao redor do molde de agarose, ressuspenda cuidadosamente o conteúdo dos moldes em um meio de 190 microlitros antes de transferir os esferóides flutuantes para um frasco de dois mililitros. Para esferoides em uma placa de baixa fixação, transfira os esferoides um por um de poços individuais para um frasco.
Deixe os esferóides assentarem no fundo do frasco para injetáveis durante cinco minutos, formando um sedimento visível. Remova a mídia do frasco, deixando os esferóides intactos, e ressuspenda-os suavemente em uma quantidade suficiente de meio 5A fresco de McCoy. Agora, transfira um volume igual de suspensão esferóide por poço da placa de microscopia.
Incube o esferóide por 1 a 2 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Adicione uma sonda de fluorescência a um volume conhecido de suspensão esferóide e continue a incubação por 1 hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, troque o meio contendo sondas fluorescentes por um volume necessário de meio de imagem.
Inicie o software de controle do microscópio e inicialize a calibração da platina. Em seguida, escolha o objetivo necessário. Escolha a janela Abrir projeto e clique em Criar um novo projeto.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse no projeto recém-criado e selecione a opção Renomear no menu suspenso. Dê um nome padrão ao arquivo do projeto de pesquisa. Abra a janela Aquisição.
Defina o comprimento de onda de excitação do laser de luz branca de pulso e a faixa necessária de detectores de varredura de ressonância ou híbridos. Em seguida, escolha os tipos de varredura de linha ou quadro. Na janela Aquisição, selecione o modo FLIM para realizar imagens combinadas com a contagem de fótons.
Em seguida, escolha a taxa de repetição de pulso do laser de luz branca. Inicie a imagem de visualização usando o modo Fast Live e ajuste o foco fino do objeto de imagem em uma seção de interesse. Observando o histograma de intensidade de pixel, ajuste o tamanho e a resolução apropriados do orifício de intensidade do laser.
Enquanto estiver no Fast Live, defina as coordenadas e a direção da varredura e atribua-as para começar e terminar na janela Z-Stack. Escolha um tamanho de passo z ou número de passos. Depois que todas as configurações necessárias forem aplicadas, comece a criar imagens.
Dê um nome apropriado à imagem e salve o projeto de imagem. Diferentes métodos de formação resultaram em tamanhos esferóides variados. Os esferoides HCT116 em placas de baixa fixação foram significativamente maiores após cinco dias em comparação com os métodos de alto rendimento.
Os métodos de baixa fixação levaram ao desenvolvimento evidente de um núcleo necrótico detectado pela coloração com iodeto de propídio. Em contraste, os esferóides gerados com outros métodos demonstraram a distribuição difusa de células mortas pelo corpo do esferoide. A oxigenação em esferoides HCT116 produzidos por diferentes métodos mostrou mais esferoides oxigenados com o microtecido e micromoldes feitos em laboratório do que a placa esférica 5D.
A oxigenação esferóide dos esferoides da placa esférica 5D mostrou menor oxigenação em comparação com microtecidos e micromoldes feitos em laboratório. A análise fasorial de esferoides HCT116 feitos usando placas de baixa fixação revela a presença de núcleos glicolíticos e não glicolíticos via NADPH-FLIM de dois fótons.
