Após a calibração do sistema de respirometria, substitua o MiR05 de cada câmara por 2,1 mililitros de solução nova de MiR05. No software de respirometria, insira as configurações do instrumento. Defina o nome do arquivo e salve as configurações.
Na próxima caixa de diálogo, insira as informações da amostra, incluindo o peso de cada amostra adicionada a cada câmara. Agora, abra a janela de calibração de oxigênio, clique em copiar do arquivo e selecione o arquivo de calibração de ar salvo. Em seguida, clique no botão calibrar e copiar para a área de transferência.
Usando uma pinça fina, transfira cuidadosamente os feixes de fibras musculares, previamente isolados do camundongo, para a solução respiratória. Coloque as rolhas na câmara e empurre-as até a metade para o fundo para fechar semi-a Assim que os anéis de vedação nas rolhas se encaixarem na parede da câmara, use um movimento de torção enquanto empurra para baixo para fechar.
Quando a câmara está meio fechada, uma pequena bolha de ar é observada no topo da câmara. Encha uma seringa de plástico de 10 mililitros com oxigênio puro de um tanque de oxigênio. Coloque a agulha longa e romba na seringa, insira a agulha na primeira câmara e forneça lentamente aproximadamente um mililitro de oxigênio.
Monitore a concentração de oxigênio da câmara. Quando a concentração atingir 350 a 400 nanomoles por mililitro, gire suavemente a rolha enquanto empurra para baixo para fechar totalmente a câmara. Observe a câmara e certifique-se de que não haja bolhas de ar.
Para normalizar os dados de fluxo de oxigênio para a massa de tecido no menu de layout, selecione o layout 06 fluxo específico por unidade de amostra. Certifique-se de que a concentração de oxigênio e o fluxo de oxigênio tenham se estabilizado após a adição de oxigênio para iniciar a medição da respiração. Usando uma seringa de vidro de 10 microlitros, adicione 2,5 microlitros de malato molar 0,8 a cada câmara.
Pressione F4 para marcar a linha do tempo e rotule a marca com o fluxo de oxigênio estável M.Record por um a dois minutos. Para glicolítico aeróbico, adicione 10 microlitros de glutamato dois molares e cinco microlitros de piruvato dois molares a cada câmara. Pressione F4 para marcar a linha do tempo e rotule a marca com GP. Registre o fluxo de oxigênio estável por um a dois minutos.
Adicione 10 microlitros de glutamato 2 molar e 10 microlitros de palmitoilcarnitina 10 milimolar a cada câmara para substratos de ácidos graxos. Pressione F4 para marcar a linha do tempo e rotule a marca com GPC. Registre o fluxo de oxigênio estável por um a dois minutos.
Usando uma seringa de vidro de 25 microlitros, adicione 20 microlitros de ADP 0,5 molar a cada câmara. Pressione F4 para marcar a linha do tempo e rotule a marca com ADP. Registre o fluxo de oxigênio estável por um a dois minutos.
Agora, adicione 20 microlitros de um succinato molar a cada câmara. Pressione F4 para marcar a linha do tempo e rotule a marca com o fluxo de oxigênio estável S.Record por um a dois minutos. Usando uma seringa de vidro de 10 microlitros, adicione cinco microlitros de quatro milimolares de citocromo c a cada câmara.
Pressione F4 para marcar a linha do tempo e rotule a marca com o citocromo c. Registre o fluxo de oxigênio estável por um a dois minutos. Titular em 3 bolus de um microlitro de um FCCP milimolar, usando uma seringa de vidro de 10 microlitros.
A edição FCCP resulta em uma breve diminuição nos níveis de fluxo de oxigênio. Aguarde até que o fluxo de oxigênio aumente e se estabilize antes de gravar. Pressione F4 para marcar a linha do tempo e marque com FCCP.
Registre o fluxo de oxigênio estável por um a dois minutos. Quando o ensaio estiver concluído, gire suavemente e puxe a rolha para cima para removê-la. Enxágue a câmara três vezes com água ultrapura, seguida de três vezes com etanol a 70%.
Coloque as rolhas nas câmaras até sentir resistência, mas não as feche completamente. Em seguida, tampe as rolhas. Salve o arquivo de ensaio e desconecte o instrumento do software.
Por fim, desligue o respirômetro. Em amostras murinas adequadamente preparadas, a adição de citocromo c pós-ADP não afetou o fluxo de oxigênio, confirmando a integridade da membrana mitocondrial externa. No entanto, quando as amostras de tecido não foram preparadas adequadamente, a adição de citocromo c pós-ADP levou a um aumento de 40% no fluxo de oxigênio, indicando danos à membrana mitocondrial externa.
