Para começar, obtenha células de leucemia cultivadas em condições ideais para transplante. Depois de contar as células, forletá-las a 300g por cinco minutos em temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. Para a coloração CM-Dil, ressuspenda as células na solução de trabalho para obter uma vez 10 elevado a seis células em 100 microlitros e incube-as a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Lave as células duas vezes com 10 mililitros de 1X HBSS em temperatura ambiente. Depois de peletar as células a 300g por cinco minutos, ressuspendê-las em PBS contendo 1% de FBS para atingir uma densidade de 40.000 células por microlitro. Em seguida, ligue o microinjetor e a bomba.
Defina a pressão de injeção para nove a 11 libras por polegada quadrada e, no tempo de injeção, para 0,5 segundos para cortar a agulha e definir o orifício. Carregue cerca de cinco microlitros da linha de suspensão de células tumorais na microagulha com cuidado, em uma única passagem, evitando a formação de bolhas de ar. Usando uma pinça Dumont 5, corte a ponta da agulha para produzir um orifício que possa suportar a ejeção.
Em seguida, selecione embriões saudáveis de peixe-zebra ao microscópio, eliminando qualquer um com anomalias de desenvolvimento. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, pegue os embriões anestesiados e arrume de 10 a 15 deles em posição lateral na placa de 1,5% de agarose. Remova o excesso de água para deixar uma quantidade mínima para a sobrevivência do embrião.
Em seguida, confirme ao microscópio óptico se a agulha está bem cortada e com células. Injete 10 a 15 nanolitros correspondentes a 400 a 600 células na gema dos embriões por 0,2 a 0,3 segundos. Depois de injetar todos os embriões, colete-os em água fresca para embriões.
Uma hora após a injeção, monitore o bolo de células para separar os embriões com coloração ideal ou bolo bom daqueles com coloração inferior ou bolo inferior. A coloração CM-Dil e a marcação de proteínas fluorescentes permitiram o monitoramento da progressão da doença por microscopia. E a sobrevivência dos embriões diminuiu após a injeção com duas linhagens de leucemia geneticamente distintas.
