Para começar, obtenha embriões de peixe-zebra injetados com células de leucemia pré-fabricadas com CM-Dil. Transfira os embriões anestesiados para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e, usando uma pipeta P200, dissolva a gema em 100 microlitros de solução de ringer livre de cálcio por cinco minutos. Incubar cada amostra de embriões desgemados com um mililitro da solução de tripsina colagenase a 29 graus Celsius por 30 a 35 minutos.
Usando uma ponta P1000, pipete os embriões para cima e para baixo nesta solução a cada cinco minutos até que a estrutura da espinha dorsal não seja mais visível. Para interromper a reação, adicione 200 microlitros de FBS ao tubo. Misture bem e incube por mais cinco minutos.
Pulverize a suspensão celular a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Uma vez descartado o sobrenadante, lave o pellet celular duas vezes em PBS resfriado e coe as células através de um filtro de células de 70 micrômetros. Depois de lavar as células, ressuspenda o pellet celular no meio de coloração contendo um anticorpo reativo com as células transplantadas.
Incube as células a quatro graus Celsius por 20 minutos. Pellet as células e ressuspendê-las em 200 microlitros de meio de coloração, contendo uma hélice micromolar e P Blue. Transfira a mistura de células para um tubo de policarbonato de fundo redondo de cinco mililitros e execute a citometria de fluxo.
A dupla marcação permitiu a medição das diferenças na carga tumoral entre a inoculação em bolus bom e inferior.
