Para infectar culturas de salmonela com fagos de bactérias, dilua uma cultura noturna de salmonella enterica em um volume final de cinco mililitros de LB e adicione 0,1 mililitros de lisado de fagos de bactérias previamente preparadas. Em seguida, incube a 37 graus Celsius e 200 RPM por 24 horas. Em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros, diluir a cultura bacteriana contendo fagos 100 vezes em cinco mililitros de LB filtrado com 0,22 mícron. Centrifugue a suspensão por 10 minutos a 2.377g.
Decantar cuidadosamente o sobrenadante, deixando algum volume no fundo para garantir a presença de células. Lave as células bacterianas com 10 mililitros de meio LB filtrado com 0,22 mícron. Depois de repetir a centrifugação e lavar três vezes, ressuspender o pellet em cinco mililitros do LB filtrado. Empregue um sistema de filtragem a vácuo para filtrar 50 microlitros da suspensão bacteriana obtida através de um filtro estéril de 0,45 mícron.
Enxágue o filtro com 100 mililitros do LB.To filtrado para facilitar a liberação de fagos das células bacterianas, incube o filtro contendo as células sem desmontar o sistema. Enxágue o filtro novamente, conforme demonstrado anteriormente, usando o sistema de filtragem a vácuo. Para recuperar as células bacterianas do filtro usando uma pinça estéril, transfira o filtro para um frasco.
Em seguida, adicione dois mililitros de 2x LB sobre o filtro e pipete várias vezes para liberar as células do filtro. Centrifugar um mililitro desta suspensão durante dois minutos a 10 354 g. Depois de descartar o sobrenadante, lave as células três vezes com um mililitro de meio LB filtrado.
Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de 2x LB. Em seguida, misture o lipopolissacarídeo comercial de salmonella enterica, ou LPS, com 20 microlitros da suspensão bacteriana em um mililitro de LB filtrado. Incube a mistura por duas horas a 37 graus Celsius com agitação a 200 RPM para evitar a reinfecção por fagos de bactérias. Em seguida, transferir um mililitro de cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugar a suspensão durante dois minutos a 10.354 g. Lave o pellet três vezes com um mililitro de meio LB filtrado.
Após a lavagem, ressuspenda o pellet em um mililitro de 2x LB. Adicione 20 microlitros desta mistura a um mililitro de LB filtrado, contendo 0,8 miligramas por mililitro de LPS comercial. E incube a mistura a 37 graus Celsius e 200 RPM por duas horas. Em seguida, faça uma pastilha de um mililitro de cultura em um tubo de microcentrífuga por centrifugação por dois minutos a 10.354g.
Depois de lavar as células três vezes com LB filtrado, ressuspenda-as em um mililitro de LB filtrado. Usando um sistema de filtragem a vácuo, passe um mililitro de suspensão bacteriana por um filtro estéril de 0,45 mícron e enxágue o filtro usando 100 mililitros de LB filtrado. Transferir o filtro para um balão com uma pinça esterilizada. Adicione dois mililitros de 2x LB sobre o filtro e pipete várias vezes para liberar as células do filtro. Centrifugue um mililitro de células por dois minutos a 10.354g antes de lavar três vezes com LB filtrado. Ressuspenda as células coletadas em um mililitro de 2x LB.To prepare o inóculo livre de fagos, adicione 100 microlitros de células da suspensão bacteriana a 900 microlitros de LB contendo 0,45 miligramas por mililitro de LPS.
Incube a 37 graus Celsius por 24 horas com agitação a 200 RPM. Use-a como alíquota para confirmar a ausência de reinfecção por fagos. Ao realizar titulações em diferentes etapas do protocolo, observou-se que a lavagem e filtragem repetidas não foram suficientes para eliminar os fagos bacterianos das culturas.
No entanto, o número de fagos diminuiu assim que uma etapa de incubação com LPS comercial foi empregada. A etapa crucial para a remoção completa dos fagos bacterianos na cultura bacteriana foi a segunda incubação com LPS comercial.
